Факультет

Студентам

Посетителям

Выделение и растворимость клейковины

Неочищенную вязкую клейковину обычно выделяют из муки осторожным отмыванием простого водно-мучного теста в воде или в разбавленном солевом растворе до удаления из довольно упругой, резиноподобной массы большей части крахмала. Известно, что на количество и свойства получаемой клейковины влияет ряд факторов, к которым относятся свойства и количество солей в промывном растворе, температура, длина периода отлежки между замесом теста и отмыванием клейковины, различия в применяемых методах и, что наиболее важно, различия в используемой муке.

Систематическое обсуждение этих факторов представлено в статьях Дилла и Алсберга и Фишера и Хэлтона.

Выделенная этим обычным способом клейковина в действительности представляет собой грубую смесь веществ и является артефактом. Около 2/3 этой массы составляет гидратационная вода. Сухое вещество содержит, в зависимости от тщательности отмывки, от 75 до 85% белка и от 5 до 10% липидов. Эти липиды связываются с белковыми компонентами в процессе приготовления из муки теста и не могут рассматриваться как нормальные компоненты клейковины. Большую часть остального сухого вещества составляет поглощенный крахмал, хотя значительную долю суммарного белкового вещества могут составлять также растворимые в воде и разбавленных солевых растворах белки. Почти все глобулины и до половины альбуминного белка муки могут «схватываться» неочищенным клейковинным студнем. Войчик и сотр. показали, например, что содержание растворимого белка в клейковине составляет 7% общего белка. Углеводы некрахмальной природы могут встречаться в значительном количестве. Кроме того, во время выделения из муки клейковинная масса, по-видимому, поглощает также ферменты.

Хотя неочищенный клейковинный студень чувствителен к теплу и к денатурирующим воздействиям различных химических веществ, он может быть легко высушен без потери исходной способности к набуханию и хлебопекарных свойств. В лабораторных условиях для этого обычно используют лиофильную сушку или сушку при комнатной температуре на воздухе или с помощью вакуум-сушильного шкафа. В промышленных условиях клейковину можно высушивать в вакууме, а также в распыленном состоянии или даже в барабанной сушилке, однако в последнем случае необходимо добавлять некоторые защитные агенты, например уксусную кислоту, для предохранения препаратов от денатурации.

В сухом виде клейковина довольно устойчива, хотя присутствующие в ней жировые вещества со временем обычно прогоркают. В сыром виде или в растворе клейковина подвергается постепенному расщеплению присутствующими в ее массе протеазами, если предварительно они не подвергались денатурации путем кратковременной тепловой обработки для стабилизации клейковины. Однако даже и при наличии такой тепловой обработки медленная деградация клейковины все-таки продолжается.

Неочищенную клейковину можно более или менее полно диспергировать в разбавленных растворах ряда кислот и щелочей в присутствии спиртов или без них и в более концентрированных растворах таких веществ, как мочевина, гуанидин, салицилат натрия и поверхностно-активные вещества. Однако ни один из этих растворителей не является вполне удовлетворительным. Растворы щелочей могут вызывать необратимые изменения свойств клейковины, по-видимому, вследствие разрыва дисульфидных мостиков; так, нейтрализация сильно щелочного раствора клейковины приводит к выделению сероводорода, присутствие которого легко обнаруживается по характерному запаху. Мочевина, гуанидин и детергенты вызывают желатинизацию и дисперсию крахмала, мешая его легкому отделению от белка.

Однако, если препараты лишены крахмала, перечисленные вещества сохраняют свое значение для физико-химических исследований. Помимо того что растворы салицилата вызывают дисперсию крахмала, его анионы, по-видимому, соединяются с белком таким образом, что стирают электрофоретические и другие различия между этими веществами. Поэтому при использовании указанных растворителей и интерпретации полученных с их помощью результатов всегда необходима известная осторожность. Кроме того, все эти растворы могут вызывать неуловимые изменения в клейковине, которые могут проявиться только при хлебопекарных испытаниях.

В качестве растворителя при работе с клейковиной, как правило, используют разбавленную кислоту, обычно уксусную, хотя часто применяют также муравьиную и молочную кислоты. Растворы клейковины в 0,01—0,1 н. уксусной кислоте до 5%-ной концентрации легко получить путем встряхивания клейковины в растворителе, причем для лучшего ее диспергирования необходимо энергичное перемешивание, например с помощью механической мешалки. Получаются непрозрачные, похожие на молоко, трудно фильтрующиеся растворы. При длительном центрифугировании, которое применяют для осаждения нерастворившегося материала, наряду с крахмалом и другими дискретными примесями в осадок обычно выпадает до 10—15% белковых веществ. Путем нейтрализации центрифугированного раствора щелочью или добавления солей можно вызвать коагуляцию растворенной клейковины и выделить ее из раствора без видимого изменения. Добавление спирта до 50- или 70%-ной концентрации позволяет снизить чувствительность белков к соли, но приводит к некоторой денатурации глютенина или по крайней мере его растворимых компонентов. 70%-ный раствор 2-хлорэтанола в 0,01 н. НСl, по-видимому, практически полностью растворяет клейковину при незначительном изменении ее свойств. В то же время безводный реактив вызывает некоторую потерю амидного азота и этерификацию карбонильных групп. Высокая токсичность 2-хлорэтанола, обычно называемого этилен-хлоргидрином, требует чрезвычайной осторожности при его использовании.

Из растворов клейковины в кислотах путем добавления солей в присутствии (или без) спирта или путем нейтрализации растворяющей кислоты можно получить различающиеся по своему составу фракции. На количество осаждающегося белка влияют следующие факторы: рН, количество соли, концентрация белка и время. При добавлении к исходной дисперсии приблизительно равного объема этилового спирта при обычной температуре соль почти не вызывает осаждения, однако при постепенном понижении температуры происходит дробное осаждение.

Фракции с варьирующей растворимостью и другими свойствами можно получить также при постепенном добавлении сульфата магния к раствору клейковины в 8—10%-ном салицилате натрия. Хогард и Джонсон получили целую систему фракций из спиртовых растворов глиадина путем осаждения при низкой температуре и вспенивания.

Специфические свойства растворимости глиадина приписывают присутствию на поверхности его молекул незначительного количества ионизируемых групп. Несмотря на значительную способность к набуханию, глиадин при значениях рН, близких к нейтральному, обнаруживает заметную тенденцию к аггрегации за счет межмолекулярных водородных связей. Хотя вода не может успешно конкурировать с силами поперечных связей (для перевода глиадина в молекулярный раствор), оказывается достаточным приложить к белку небольшой заряд (например, титруя его раствор при рН ниже 4), чтобы сдвинуть равновесие сил в направлении увеличения притяжения к воде до такой степени, когда молекулы могут перейти в раствор. Увеличение ионной силы снижает эффективность приложенного заряда и меняет тенденцию глиадина к диспергированию в пользу сил интермолекулярного притяжения, существующих между этими белковыми молекулами. Спирты, мочевина, формамид и другие соединения, которые более, чем вода, способствуют образованию водородных связей, конкурируют с межмолекулярными водородными связями глиадина, делая растворимость белка гораздо менее чувствительной к ионной силе. Силы гидрофобного притяжения между неполярными боковыми цепями глиадина и другими молекулами клейковины также должны способствовать их нерастворимости в нейтральной водной среде. Связи такого типа обычно легче, чем «водородные» связи, разрушаются менее полярными растворителями, чем вода. Этим, в частности, объясняется хорошая растворимость глиадина в водном этаноле. Глютенин, по-видимому, имеет более ионизированный характер, чем глиадин, хотя специфические свойства его растворимости очень затрудняют работу с ним.

Было предпринято много попыток выделения из клейковины и глиадина воспроизводимых и гомогенных фракций с использованием различных сочетаний солей, кислот, спиртов и т. д., однако до последнего времени не было надежного критерия для оценки успеха таких исследований. Тем не менее, было показано, что действительное отделение глютенина от глиадиновых компонентов может быть достигнуто повторным доведением рН раствора клейковины в 70%-ном этаноле, в разбавленной кислоте или буферах с низким рН до определенного значения. Так, например, глютенин выпадает в осадок из алюминий-лактатного буфера (рН 3,5), когда рН доводят до величины 4,6; повторение этого приема позволяет получить препарат, по существу свободный от глиадина. Однако наилучшие результаты получаются, по-видимому, путем создания определенного рН раствора клейковины в 0,1 н. уксусной кислоте, содержащей 70% этанола.

Глютенин и глиадины могут быть разделены также с помощью методов гелевой фильтрации. С помощью ионообменной хроматографии на колонках из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) Войчик, Димлер и Сенти получили высокоочищенные отдельные компоненты клейковины, что подтверждено исследованием их электрофоретических и адсорбционно-элюционных свойств. Клейковину, растворенную в 0,01 н. уксусной кислоте (рН 3,4), адсорбировали на уравновешенной колонке из КМЦ и элюировали путем изменения рН элюирующего буфера, которое осуществляется добавлением к исходному буферу соляной кислоты, чтобы получить значения рН от 3,4 до 1,5. Градиентной элюцией не удалось выделить элюируемый белок в виде отдельных хроматографических пиков, хотя электрофоретическое исследование выбранных наугад фракций показало постепенное изменение состава их компонентов. Окончательная очистка компонентов завершалась повторным хроматографированием основных фракций в тех же самых системах. Состав фракции исследовали с помощью электрофореза с подвижными границами в алюминий-лактатном буфере (рН 3,1) при ионной силе, равной 0,1. Полученным четырем отдельным фракциям клейковины были даны названия гамма — и омега-клейковина (при последующем пересмотре классификации эти фракции получили название альфа-1- и альфа-2-глиадин и бета-, гамма-и омега-глиадины (смотри ниже таблицу номенклатурных согласований). Альфа-1-компонент (позднее названный глютенином) так прочно связывается с колонкой, что для его элюции требовался раствор мочевины; однако растворимость в лактатном буфере выделенного вещества была настолько низкой, что оказалось невозможным провести электрофоретический анализ данной фракции. Для выделения этого компонента с целью изучения воспользовались избирательным осаждением его из раствора клейковины при увеличении рН или ионной силы.

В связи с тем, что образование неочищенного клейковинного студня, выделенного из теста с помощью общепринятой методики отмывания, может быть артефактом, многие исследователи пытались экстрагировать компоненты клейковины прямо из муки, предварительно обезжиренной и промытой разбавленными растворами солей для удаления растворимых белков. Сравнение на крахмальном геле электрофоретических свойств компонентов клейковины, выделенных из клейковинного студня или из промытой буфером муки, в основных чертах показало сходство глиадиновых компонентов. Трудность извлечения малорастворимого белка из муки осложняла сравнение глютенинового компонента. Как уже указывалось, при осветлении разбавленных растворов клейковины, перед их изучением, путем центрифугирования оседает от 10 до 15% белковых веществ. В настоящее время нет определенного мнения относительно свойств этой части клейковины, что представляет пробел в имеющихся в нашем распоряжении сведениях о белках клейковины. Сравнение электрофоретических свойств клейковины, полученной из фракций муки, богатых промежуточным и прикрепленным белком, показало, что эти фракции электрофоретически идентичны и присутствуют в тех же относительных концентрациях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: