Факультет

Студентам

Посетителям

Электрофорез клейковины

Ограниченная растворимость, о которой говорилось выше, до недавнего времени представляла серьезную помеху для физико-химического исследования клейковины и ее фракций. Хотя Холм и Бриггс указали на необходимость использования буферов с низкой ионной силой для электрофореза глиадина, электрофореграммы, полученные с 1%-ными растворами белка, не обнаруживали симметрии в восходящем и нисходящем коленах, если к использованным буферам не добавляли мочевину до концентрации 3М.

При рН 3,8 наблюдали три компонента, причем пики обнаруживали прекрасную симметрию, что указывает на вполне определенную гетерогенность глиадина.

Значительно больший шаг вперед сделали Джонс, Тэйлор и Сенти, которые снизили концентрацию белка до 0,3%, а ионную силу до 0,03 или ниже. Клейковина, диспергированная при рН 3,1 в натрий-лактатном, натрий-фосфатном, натрий-хлорацетатном и натрий-ацетат-НСl-буферах, давала совершенно симметричные электрофореграммы, ясно указывающие на гетерогенность белковой смеси. В натрий-лактатном и натрий-фосфатном буферах было обнаружено четыре пика, обозначенных как альфа, бета, гамма и омега. В натрий-хлорацетатном и в натрий-ацетат-НСl-буферах альфа-пик распадался на два пика, но маленький, омега-пик, при этом пропадал. Миллс также исследовал клейковину в ацетат-НСl-буфере при аналогичных условиях и обнаружил четыре пика на восходящей границе, но не получил симметричных границ.

Перейдя на алюминий-лактатные буферные смеси, Джонс с сотр. смогли вполне успешно работать с растворами клейковины до 0,8%- ной концентрации, которые еще обнаруживали на электрофореграмме прекрасную симметрию; правда, альфа-пики при этом не удавалось разложить. Можно думать, что при этой более высокой концентрации бета-пик состоит более чем из одного компонента. Хлорацетат алюминия не обнаруживал преимуществ перед натриевым буфером, поскольку для достижения симметрии концентрация белка должна быть снижена до 0,3% или более. Альфа-пики достаточно хорошо разделялись в любом из хлорацетатных буферов. В общем установлено, что в образцах клейковины из обычной пшеничной муки присутствует по крайней мере шесть различных электрофоретических компонентов. Дополнительные компоненты были обнаружены в образцах клейковины из муки твердых пшениц, однако обозначений по-гречески, а также данных о величинах подвижности для этих компонентов не приводится. В большинстве опытов по электрофорезу отмечены быстро перемещающиеся пики, которые, исходя из величин подвижности, полученных для растворимых белков, найденных в отмытой клейковине, считают принадлежащими альбуминным или глобулиновым белкам. Меньшие компоненты в указанном опыте составляли около 8% общего белка использованной клейковины.

Нагревание растворов диспергированной в кислоте клейковины с целью инактивации ферментов не вызывало никакого изменения в электрофоретической картине. Общая картина для образцов клейковины, полученных из муки, не обезжиренной бутиловым спиртом, перед приготовлением теста показывает определенное заострение главного пика (альфа-компонентов). Это позволяет предполагать, что липиды связываются с этими компонентами в процессе тестообразования.

Относительные величины некоторых электрофоретических компонентов и их подвижность при рН 3,1 и ионной силе, равной 0,03, в различных буферах, установленные Джонсом и др. Последующая работа показала, что компонент альфа-1, растворимый в хлорацетате, является глютенином, в то время как компонент альфа-2 правильнее было бы назвать альфа-1- и альфа-2-глиадинами.

Неопровержимым доказательством для признания идентичности уже описанных компонентов при электрофорезе в растворе явилось выделение Войчиком с сотр. отдельных компонентов и установление соответствия между электрофоретическими свойствами индивидуальных компонентов и их двойников в исходных смесях. Последующее применение большей разделяющей силы электрофореза на крахмальном геле в присутствии мочевины позволило выявить восемь компонентов, перемещающихся внутри геля как глиадиновые компоненты. Часть нанесенного белка оставалась на старте; по-видимому, вследствие слишком большой величины молекул белка эта часть не могла пройти через гелевую структуру. Возврат этой неподвижной фракции и исследование ее с помощью электрофореза в растворе показали, что она передвигается со скоростью, соответствующей скорости альфа-фракции клейковины, рассчитанной Джонсом с сотр.

Дальнейшая характеристика этой неподвижной фракции показала, что она соответствует классической глютениновой фракции клейковины.

Показано, что две наиболее быстро передвигающиеся полосы при электрофорезе в растворе перемещаются вместе, как ранее упомянутый альфа-2-пик. Четыре менее быстро движущиеся полосы соответствуют одному бета-пику при электрофорезе в растворе.

Обнаружение дополнительной гетерогенности пшеничной клейковины с помощью гелевого электрофореза приводит к необходимости пересмотра номенклатуры, принятой в ранних публикациях.

Подобное распределение компонентов клейковины было установлено также с помощью гелевого электрофореза при отсутствии мочевины, причем препараты клейковины дают восемь подвижных полос, тогда как препараты глютенина — ни одной. Другие авторы, используя электрофорез на бумаге и в растворе, обнаружили семь компонентов клейковины. Затрудненное передвижение компонентов по бумаге в этом случае легко могло помешать обнаружению какой-либо малой полосы, а асимметрия границ, отмеченная во втором сообщении, затрудняла интерпретацию полученной электрофореграммы. Неоднократно наблюдавшиеся небольшие количества быстро движущихся компонентов в растворах, полученных из отмытой из теста клейковины, по-видимому, могут объяснить сообщения о присутствии в клейковине 20 и более компонентов. Непосредственная экстракция муки алюминий-лактатными буферами позволяет получать препараты, обнаруживающие при электрофорезе на крахмальном геле присутствие по крайней мере 20 компонентов. Тождественность большинства из этих компонентов с компонентами глиадина, альбумина или глобулина могла бы быть легко установлена путем сравнения скорости передвижения каждого из этих компонентов.

Было показано, что удаление загрязняющих растворимых белков при фракционировании клейковины, полученной путем отмывания из теста, практически невозможно, по-видимому, по причине физического загрязнения и вследствие обмена в процессе тестообразования между сульфгидрильными и дисульфидными группами, связывающими растворимые компоненты. Подобным образом даже четырежды переосажденный препарат глютенина все еще обнаруживал следы глиадиновых компонентов. Через несколько дней стояния при 4 градусах, отмечались изменения в концентрации быстро передвигающихся компонентов, вероятно, альбумина и глобулина, за счет глиадиновых компонентов, что могло быть результатом диссоциации рыхло связанных компонентов или результатом действия ферментов, но точных доказательств в пользу того или иного предположения пока нет. Обработка растворов клейковины различными протеолитическими ферментами не воспроизводит этот эффект. Тщательное отмывание клейковины, выделенной из теста, не позволяет получить всю сумму растворимого белка, который извлекается при прямой экстракции муки. Прямая экстракция муки солевыми растворами также не позволяет удалить все растворимые компоненты. Например, альбумин, растворимый в разбавленных растворах фосфатов, осаждается при добавлении сульфата калия до концентрации 0,5М. Таким образом, выводы относительно подлинности или происхождения электрофоретически разделяющихся компонентов в препаратах клейковины или ее фракциях должны быть сделаны с известной осторожностью и желательно с привлечением иных, чем свойства растворимости, доказательств.

Применение в самое последнее время метода иммуноэлектрофореза на агаровом геле в исследовании глиадина показало, что этот многокомпонентный материал дает только одну преципитиновую линию против иммунной сыворотки, приготовленной против нерастворимого пшеничного белка. Для приготовления иммунной сыворотки и для осуществления иммунохимической преципитации были использованы растворение глиадина в растворах мочевины и превращение его в полиаланильные производные. Эти результаты подтверждают точку зрения о том, что среди компонентов клейковины или по крайней мере среди глиадиновых компонентов существует значительное сходство в составе и структуре.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: