Факультет

Студентам

Посетителям

Диспергирование клейковины растворами кислот

Разбавленные водные растворы органических и неорганических кислот неоднократно применялись для полного растворения клейковины и изучения ее свойств в диспергированном состоянии. Еще Вуд и Гарди в 1908 г. (цит. по Blish, 1945) показали, что клейковина постепенно переходит в раствор при обработке ее 0,0001 п соляной кислотой. Скорость диспергирования увеличивается с повышением концентрации HCl до 0,033 п, а затем падает. Н. П. Козьмина (1936) отметила набухание и постепенное растворение сырой клейковины в 0,005—0,01 п растворах соляной и серной кислот, наряду с уплотняющим действием тех же кислот при более высоких концентрациях, порядка 0,1 п.

Мэнгельс и Мартин (Mangels, Martin, 1935) подробно исследовали степень извлечения белковых веществ из пшеничной муки при обработке ее уксусной, щавелевой, молочной, винной, лимонной, а также пропионовой, масляной, валерьяновой, янтарной, монохлоруксусной, трихлоруксусной, серной, соляной и ортофосфорной кислотами в концентрациях от 0,1 до 2,0 п. Было показано, что растворяющее действие кислоты зависит не только от величины рН, но и от ее природы. Органические кислоты при равном рН извлекают из муки больше белка, чем неорганические. Для большинства органических кислот максимум пептизирующего действия наблюдается при концентрации их около деципормальной. 0,1 п растворы уксусной, молочной, винной и лимонной кислот извлекают около 85% общего азота муки: другие кислоты — 70—75%.

Приведенные данные показывают, что при экстрагировании муки кислотами полного растворения клейковины не происходит, что, по мнению Лузена (Lusena, 1950), зависит от присутствия в муке солей, снижающих растворимость белковых веществ. Если же обрабатывать растворами кислот не муку, но непосредственно сырую клейковину, то последняя полностью пептизируется, образуя гомогенную дисперсию.

Наиболее изучено диспергирование сырой клейковины в уксусной кислоте при концентрации ее 0,01—0,10 п (Sandstedt, Blish, 1933; Blish, 1945; Lusena, 1950; Lusena, Adams, 1950; Pence, Olcott, 1952; Udy, 1953; Pfeifer, Vojnovich, Anderson, 1958). Если с помощью центрифугирования удалить из такой дисперсии крахмал, а затем осторожно нейтрализовать ее слабой шелочью (например Са(ОН)2), или прибавить небольшое количество нейтральной соли (обычно NaCl), то клейковина выпадает в виде осадка, который при промывании и разминании в воде проявляет характерные свойства первоначальной сырой клейковины.

Эти наблюдения показывают, что разбавленная уксусная кислота не денатурирует клейковину в такой степени, как растворы щелочей, поскольку основные физические свойства, характерные для клейковины,— упругость, связность, растяжимость — сохраняются после выделения клейковинного белка из уксуснокислой дисперсии.

Диспергирование сырой клейковины в разбавленной уксусной кислоте положено в основу нескольких методов приготовления сухих препаратов клейковины, очищенной от примесей и сохранившей свои «нативные» свойства, т. е. способной при повторном увлажнении вновь образовать сырую клейковину, идентичную первоначальной. Так, Лузена (Lusena) и Лузена и Адаме (Lusena, Adams) предложили в 1950 г. получать сухую «нативную» клейковину, диспергируя исходную сырую клейковину в 0,005—0,01 п уксусной кислоте, очищая дисперсию центрифугированием, а затем удаляя воду и уксусную кислоту либо с помощью лиофилизации, либо в специальном сушильном аппарате, где распыленная дисперсия клейковины быстро сушится потоком горячего воздуха (при температуре 79—149°). Недавно Пфейфер, Войнович и Андерсон (Pfeifer, Vojnovich, Anderson, 1958) предложили производственный способ получения сухой неповрежденной клейковины путем диспергирования исходной сырой клейковины в уксусной кислоте при рН от 4,5 до 5,1 с последующей быстрой сушкой дисперсии в специальной сушилке барабанного типа при температуре 130—164°.

Получаемые всеми этими методами сухие порошки клейковины при увлажнении вновь образуют сырую клейковину, что и дало указанным авторам основание говорить о «нативности» приготовленных ими клейковинных препаратов. С этим утверждением, однако, нельзя согласиться. Дело в том, что ни один из цитированных авторов не сравнил физические свойства исходной и регенерированной из уксуснокислой дисперсии сырой клейковины с помощью объективного измерения основных показателей этих свойств, например растяжимости, упругости и т. п. Было констатировано только, что при замешивании с водой обезвоженных препаратов клейковины или при разминании с водой сырых осадков, выделенных из уксуснокислой дисперсии исходной клейковины, получается связная масса, которая по своим свойствам, определяемым органолептически, является, несомненно, клейковиной. Известно, однако, что даже при органолептической оценке отдельные образцы могут резко различаться по своему качеству.

В какой же степени регенерированная из уксуснокислой дисперсии клейковина идентична по своему качеству исходной сырой клейковине? Авторы описанных выше методов приготовления «нативных» препаратов сухой клейковины ответа на этот вопрос не дают. Между тем, еще в 1936 г. Рич (Rich) указывал, что белок, осажденный при нейтрализации дисперсии клейковины в разбавленной кислоте (при рН около 3,0), значительно отличается по своим физическим свойствам от исходной сырой клейковины. Даже если не учитывать возможного денатурирующего действия на белок обезвоживания, особенно сушки при высокой температуре, следует считаться с изменениями клейковины непосредственно под влиянием кислоты. В этом отношении интересны работы Роуза и Кука (Rose, Cook, 1935; Cook, Rose, 1935), показавших, что при хранении диспепсий сырой клейковины в 0,1 п уксусной кислоте на протяжении нескольких

Суток происходит непрерывное падение вязкости, особенно при повышенной температуре. Одновременно происходит постепенное гидролитическое расщепление белка, определяемое нарастанием азота, не осаждаемого трихлор-уксусной кислотой. В зависимости от температуры и длительности хранения дисперсий содержание небелкового азота в них может достигать от 3,4 до 33,4% от общего азота диспергированной клейковины. Внешних изменений в дисперсии при хранении не происходит, она остается гомогенной, осадка не образуется, однако если по прошествии трех недель выделить клейковинный белок с помощью нейтрализации уксусной кислоты и высаливания сернокислым магнием, то получаемый осадок не обладает физическими свойствами сырой клейковины, т. е. является полностью денатурированным. Дальнейшее изучение природы изменений уксуснокислых дисперсий клейковины было выполнено Олкоттом, Сапирштейном и Блишем (Olcott, Sapirstein, Blish, 1943) и Олкоттом (Olcott, 1950).

На основании своих опытов эти авторы пришли к заключению, что снижение вязкости, а также увеличение неосаждаемого трихлоруксусной кислотой и формольнотитруемого азота в уксуснокислых дисперсиях сырой клейковины (0,1 п СН3СООН) при их хранении имеет энзиматический характер и зависит от присутствия особой «клейковинной протеиназы» (gluten proteinase), отличающейся рядом свойств (оптимум рН; инактивация салицилатом) от обычной протеиназы пшеничного зерна папаинового типа. Если дисперсию клейковины в 0,05 —0,10 п уксусной кислоте прогреть, в течение 5—10 минут при 100°, например, с помощью простой аппаратуры, предложенной Олкоттом (Olcott, 1950), то тепловая инактивация «клейковинной протеиназы» стабилизирует дисперсию и ее можно хранить без изменения вязкости и небелкового азота. В то же время опыты указанных авторов показали, что прогревание не изменяет свойств самой клейковины. Растворимость ее не меняется, кривые высаливания сернокислым магнием имеют одинаковый характер для прогретых и непрогретых дисперсий и при высаливании оседает белок, обладающий эластическими свойствами исходной сырой клейковины. Если приготовить смесь из прогретой и непрогретой уксуснокислых дисперсий сырой клейковины, то при хранении ее наблюдается падение вязкости более значительное, чем то, которое можно вычислить, исходя из количества непрогретой клейковины в смеси.

Этот факт показывает, что фермент, присутствующий в непрогретой части дисперсии, способен расщеплять как исходный, так и прогретый белок, что свидетельствует, по мнению авторов, об отсутствии изменений клейковины в результате нагревания дисперсии. Все попытки получить клейковину, свободную от «клейковинной протеиназы», путем тщательного отмывания водой и солевыми растворами, переосаждения из уксусной кислоты и другими способами не имели успеха. При фракционировании клейковины оказалось, что фермент связан преимущественно с ее глютениновой фракцией. Фермент имеет оптимум активности при рН 3—4 и обратимо инактивируется салицилатом натрия.

Работ по дальнейшему изучению «клейковинной протеиназы» пока не было опубликовано.

Приведенные данные об отсутствии изменений уксуснокислых дисперсий клейковины в результате их прогревания противоречат обычным представлениям о тепловой денатурации белка в растворах и нуждаются, по-видимому, в проверке.

В литературе имеются и противоположные данные. Например, в работе Юди (Udy, 1953) было показано, что 15-минутное прогревание клейковины, диспергированной в 0,05 М уксусной кислоте на кипящей водяной бане, вызывает немедленное снижение относительной вязкости дисперсии, что свидетельствует об определенной деструкции клейковинного белка в процессе тепловой денатурации.

Значительный интерес представляют исследования, посвященные действию восстановителей на клейковину, диспергированную в уксусной кислоте. Олкотт, Сапирштейн и Блиш в цитированной выше работе показали, что прибавление монотиогликоля (0,01 М), бисульфита натрия (0,004 М), цистеина и цианистого калия к дисперсии сырой клейковины в 0,1 п уксусной кислоте резко снижает ее вязкость без значительного увеличения аминного азота. Так как этот эффект был почти одинаковым в опытах с прогретой и непрогретой дисперсиями клейковины, авторы пришли к выводу, что восстановители действуют в первую очередь непосредственно на клейковинные белки, тогда как активирование ими ферментов папаинового типа имеет, вероятно, второстепенное значение.

Юди (Udy, 1953) также наблюдал быстрое снижение относительной вязкости 6%-ной дисперсии клейковины в 0,05 М уксусной кислоте после добавления к ней восстановителей: бисульфита натрия (0,005 и 0,0025 М) и тиогликолевой кислоты (0,005 и 0,01 М). Минимальное значение вязкости достигалось через несколько часов после добавления восстановителей. Некоторые различия в вязкости, существовавшие между дисперсиями клейковины разного качества, сглаживались в результате действия восстановителей. Юди считает, что восстановители оказывают влияние на электростатическое взаимодействие частиц клейковинного белка в дисперсии и на дисульфидные связи белковых молекул, разрывая эти связи. Если же концентрацию бисульфита натрия в уксуснокислой дисперсии клейковины повысить до 0,01-молярной, то вязкость дисперсии возрастает и образуется гель. Вероятно, причиной этого является возникновение новых ассоциативных связей, возможно водородных, между восстановленными участками белковых молекул клейковины.

Как указывалось выше, клейковина легко диспергируется не только в уксусной, но и в других кислотах. Гаррис и Фрокджер (Harris, Frokjer, 1952) считают, что молочная кислота при концентрации 0,013 п лучше диспергирует сырую клейковину, чем уксусная и муравьиная кислоты, причем в зависимости от исходного качества клейковины пептизация ее в молочной кислоте протекает с различной скоростью.

Указанные авторы разделили клейковину из мягкой и твердой пшеницы на три фракции путем постепенного осаждения их из дисперсии сырой клейковины в молочной кислоте гидратом окиси кальция, добавлявшимся последовательными порциями до рН 5,0, 5,5 и 7,0. Каждая фракция собиралась отдельно и высушивалась в токе воздуха при комнатной температуре. Распределение клейковины из твердой и мягкой, пшеницы по фракциям было совершенно различным.

Весьма интересные, принципиально новые результаты были получены при диспергировании белкового комплекса зерновых культур в растворах муравьиной кислоты. Этим методом Кэннингхэму и Андерсону (Cunningham, Anderson, 1950), а также Хагбергу (Hagberg, 1952) удалось впервые получить клейковину из зерна ржи. Выделение клейковины проводилось следующим образом (Cunningham, Geddes, Anderson, 1955а, б). Вначале муку экстрагировали дистиллированной водой, отделяли остаток центрифугированием и обрабатывали его 0,01 п муравьиной кислотой в гомогенизаторе Уоринга. Полученный экстракт осаждали насыщенным раствором Са(ОН)2. В опытах с пшеницей, ячменем и рожью выпадал осадок, обладающий характерными физическими свойствами клейковины, тогда как из овсяной муки белок, выделенный в тех же условиях, представлял собой глиноподобную массу, резко отличавшуюся от клейковины. Содержание азота во всех четырех препаратах (из пшеницы, ячменя, ржи и овса) было около 16% и не повышалось заметным образом при повторных переосаждениях. Содержание воды в сырых препаратах клейковины составляло для пшеницы 65.0%, для ржи 70,3 % и для ячменя 55,2%. Для экстрагирования муки с таким же успехом можно использовать щавелевую и лимонную кислоты. Осаждение клейковины из экстрактов муки в 0,01 п муравьиной кислоте осуществляется не только нейтрализацией экстрактов, но и с помощью высаливания небольшими количествами хлористого или муравьинокислого натрия (без предварительной нейтрализации), причем при одинаковой ионной силе растворов формиат натрия высаливает белок эффективнее, чем хлорид. Если же предварительно снизить концентрацию водородных ионов в экстракте от исходной величины рН 3,0—3,2 до рН 6,0 (для пшеницы), то для осаждения клейковины требуются меньшие количества соли. Кеннингхэм, Геддес и Андерсон (Cunningham, Geddes, Anderson, 1956) объясняют факт осаждения клейковины солями образованием нерастворимых соединений между белком и катионом соли, причем ионы, конкурируя с катионами солей, препятствуют осаждению. Характер осаждаемой сырой клейковины одинаков как в случае нейтрализации, так и в случае высаливания муравьинокислых экстрактов муки.

Дисперсии клейковины в органических кислотах были использованы некоторыми авторами для изучения электрофореза клейковинного белка, находящегося в растворе целиком, без разделения на фракции. Лоус и Фрэнс (Laws, France, 1948) провели сравнительное электрофоретичсское исследование клейковины из шести образцов муки, резко различавшихся по своим хлебопекарным качествам от «очень плохой» до «очень хорошей». Дисперсии сырой клейковины в 0,07 п уксусной кислоте содержали после диализа против цитратно-фосфатного буфера с тем же рН (2,15) 88—98% исходной клейковины. Никаких существенных различий в диаграммах электрофореза для клейковины из образцов муки разного качества обнаружить не удалось. Такие же результаты получили при электрофорезе салициловых дисперсий клейковины, а также спиртовых и водных вытяжек исследуемой муки.

Авторы отмечают, что добавление клейковины (как сырой, так и сухой), отмытой из исследуемых образцов муки, к одной и той же исходной муке увеличивало объем выпекаемого хлеба во всех случаях практически одинаково. Это позволяет предполагать, что резкие хлебопекарные различия изучаемых образцов муки зависели не от разного качества клейковины, а от других причин. Авторы, к сожалению, не указывают, каково было качество клейковины в муке; это не позволяет сделать какие-либо выводы о связи физических свойств клейковины с ее электрофоретической характеристикой. Несколько позднее Лонти, Кревекер и Дульцино (Lontie, Crevecoeur, Dulcino, 1954) опубликовали результаты электрофоретического исследования пшеничной клейковины в лактатном (0,015 М молочной кислоты +0,015 М лактата Na) и формиатном (0,01 М муравьиной кислоты + муравьинокислый натрий) буферах. В обоих случаях было показано, что белок клейковины состоит из трех главных и двух второстепенных компонентов, способных передвигаться в электрическом поле с различной скоростью.

Джонс, Тэйлор и Сенти (Jones, Taylor, Senti, 1959) подробно исследовали электрофорез клейковины в следующих буферных смесях (при рН = 3,1): 1) хлоруксусная кислота — хлорацетат натрия; 2) фосфорная кислота — фосфат натрия; 3) соляная кислота — ацетат натрия; 4) молочная кислота — лактат алюминия. Наилучшей оказалась последняя буферная смесь. Клейковина была разделена на 6 компонентов, содержавших 44; 22; 15 (два компонента); 16 и 3% от общего количества белка. Диаграммы электрофореза для клейковины из мягких пшениц с резко различными хлебопекарными качествами получились практически одинаковыми. Однако необходимо иметь в виду, что подготовка исходных препаратов клейковины была неудовлетворительной в отношении возможности денатурации белка (обезжиривание муки н-бутанолом, использование гомогенизатора, инактивация ферментов при 100° и др.).

Элтон и Эверт (Elton, Ewart, 1960) провели электрофорез клейковины, диспергированной в 0,01 п уксусной кислоте на колонке крахмального, геля и получили 8 отдельных белковых фракций. Центнер (Zentner, I960) с помощью непрерывного электрофореза на бумаге разделил клейковину (в 0,01-молярной, молочной кислоте) на семь фракций, наибольшая из которых давала отчетливую реакцию на липиды и углеводы.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: