Развитие учения о L-формах различных видов микроорганизмов, основанного на признании трансформации микробной клетки в зависимости от изменяющихся условий ее обитания, является самым крупным достижением микробиологической науки последнего времени.
Эти достижения имеют чрезвычайно важное значение для дальнейшего изучения большой группы патогенных микроорганизмов, отнесенных к роду Brucella. Еще совсем недавно весь смысл изучения патологии и иммунологии при бруцеллезе сельскохозяйственных животных связывался только с типической S-формой бруцелл, что затрудняло эпизоотологический анализ, неправильно ориентировало в отношении иммунологической перестройки и сущности иммунитета при бруцеллезе животных.
Вместе с тем вопрос об изучении L-форм бруцелл еще не получил своего завершения. Возможно даже, что те константы, которые в полной мере определяют L-формы у других видов микроорганизмов, никогда не будут приемлемы для бруцелл.
Впервые на клетки бактерий в культурах Streptobacilus moniliformis, очень сильно измененные по размерам, характеру протоплазмы, морфологии колоний, обратила внимание Клинбергер-Нобл (Klineberger-Nobel) еще в 1935 г. Она назвала эти варианты микроорганизмов L-формами. Причем вначале автор считала их посторонней микрофлорой, загрязняющей исходные культуры.
Однако в 1939 г. Дин (Dienes) установил, что здесь имеет место не загрязнение исходных культур, а внезапно возникший новый вариант в культурах S. moniliformis. Затем появилось большое количество работ в этом направлении за рубежом и в пашей стране.
Обобщая литературные данные об источниках И стимулах L-формообразования у бактерий, Минх, Флек (Minch, Fleck, 1970) указывают, что L-формы могут возникать спонтанно, когда бактерии культивируются в неблагоприятных условиях или, когда в среду культивирования попадают вредные вещества. Скопление в среде остатков метаболизма, повышенная концентрация аминокислот в ней, витаминов, наличие антител, бактериофага или антибиотиков также могут быть стимулами образования L-форм микробов.
Установлено, что пенициллин является пока самым эффективным индуктором формирования L-форм различных видов бактерий. Такого мнения придерживаются Танбенек, Гумперт (Tanbeneck, Gampert, 1967) и др. Однако некоторые исследователи, например Лундман, Форман (Lundman, Forman), считают, что глубокие изменения микроорганизмов могут происходить под влиянием антител и бактериофага, т. е. в условиях, которые могут складываться в инфицированном организме.
Немаловажное практическое значение, как указывают Вейбул и Гудер (Weibull a. Gooder, 1970), имеет и образование измененных вариантов бактерий, которые могут быть отнесены к L-формам, возникающим при скоплении в среде культивирования остатков метаболизма.
В. Д. Тимаков и Г. Я. Каган (1961, 1963, 1973) считают, что L-формы — это измененные варианты бактерий, возникающие при разнообразных воздействиях, блокирующих синтез клеточных стенок. Они растут, как пишут авторы, на соответствующих средах, содержащих трансформирующий агент, в виде L-колоний, которые состоят из разнообразных по форме и размерам тел, вакуолизированных форм и элементарных фильтрующихся частиц. Такое определение совпадает принципиально с темп изменениями, которые мы наблюдаем у бруцелл. Далее авторы указывают, что у L-форм полностью отсутствуют бактериальные клетки обычной морфологии, свойственной данному виду, и что L-формы способны стабилизироваться и передаваться в субкультурах.
Г. Я. Каган (I960) на основании сопоставления многочисленных литературных данных и собственных исследований считает, что первичной фазой образования L-форм являются набухание бактерий, образование гигантских шаровидных тел, ветвистых форм, проходящих определенные этапы развития, завершающиеся образованием L-культур. Проведенный автором анализ позволил сделать заключение о том, что L-формы бактерий могут рассматриваться как своеобразная форма изменчивости приспособительного характера, закономерно существующая в определенных условиях и принципиально отличающаяся от других, в том числе дегенерирующих форм.
У большинства грамотрнцательных бактерий (S. typhi, Pr. Vulgaris. у стрептококков и гонококков), поданным автора, образование L-форм носит характер непосредственной первичной реакции на измененные условия культивирования. Уже через 4—7 дней выращивания, как указывает автор, в первичном материале (посеве) бактериальной популяции наблюдается образование этих форм.
В. Д. Тимаков и Г. Я. Каган (1961, 1973) указывают, что образование L-форм зависит от вида бактерий, состояния популяции, качественного и количественного подбора L-трансформирующего вещества. Однако для получения и культивирования L-форм грамотрицательных видов бактерий стабилизаторы не требуются. Наши наблюдения, изложенные ниже в отношении бруцелл, совпадают с этими данными.
За последние годы уточнились взгляды на причины возникновения изменчивости бактерий, связанной с повреждением стенки микроорганизмов, что повлекло к уточнению классификации форм изменчивости. Полученные результаты многих исследователей позволили расширить представление об L-трансформации бактерий. В обзорах по этому вопросу приводятся схемы классификации и обозначения изменчивых бактериальных форм с нарушенной клеточной стенкой.
Минх и Флек (1970) в своих работах по вопросам изменчивости бактерий пользуются термином протопласты. Как указывает Туланс (Tulanse, 1951), протопласты — это такие формы, у которых полностью отсутствуют перегородки, они выживают только в гипертонической среде, неспособны размножаться.
Собственно L-формы бактерий принято разделять на 3 типа.
1. Тип А L-форм бактерий — стабильные, или устойчивые, бактериальные формы, которые, как правило, не реверсируют в исходную родительскую форму, независимо от отсутствия индуктора.
2. Тип В L-форм бактерий нестабильные, или неустойчивые, бактериальные формы, способные к реверсии в исходную бактериальную форму. Дин (1962), Туланс (1960) и др. считают, что L-формы типа В по существу являются сферопластами. У них сохраняются частично перегородки, и они обладают способностью под влиянием индуктора синтезировать исходную бактериальную стенку материнских клеток.
3. Тип С L-форм бактерий микроорганизмы, тождественные по своему строению с микроорганизмами типа В, но не обладающие способностью реверсировать в исходную бактериальную форму. Этот тип L-форм бактерий также отождествляется со сферопластами. Таким образом, сферопласты отождествляются с L-формами и разделяются на способных и не способных к реверсии.
Минх и Флек (1970) пишут, что не существует определенного типа L-форм бактерий, так как может быть столько же L-форм, сколько видов бактерии и сколько применяется различных технических приемов для их Трансформации. Отсюда понятны трудности классификации измененных бактерий с нарушенной стенкой клеток.
Анализ классификации измененных вариантов бактерий с дефектом стейки приводит в обзоре Мак-Г и, Виттер, Гудер и Чараки (McGee, Witter, Gooder, Characke, 1971).
Различают классифицированные и неклассифицированные варианты бактерий.
К классифицированным вариантам относят: протопласты, сферопласты, варианты переходной фазы и варианты L-фазы.
Протопласты это микробные варианты с нарушенными стенками, когда снаружи отсутствуют все элементы стенки клеток. Они не чувствительны к пенициллину, грамотрицательны, не способны к размножению.
Сферопласты это такие формы, у которых частично сохраняются на поверхности элементы стенки клеток. Они не воспроизводятся, если получены под воздействием пенициллина, но могут реверсировать в исходную форму или перейти в L-форму.
Варианты переходной фазы — это такие формы, у которых отдельные микроорганизмы выражен но варьируют (окраска по Граму, морфология, чувствительность к пенициллину и т. д.). Морфология колоний варьирует от пассажа к пассажу. Могут переходить в L-форму.
Варианты L-фазы — это такие микроорганизмы, колонии которых ввиду врастания в среду имеют вид яичницы из множества яиц или вид сотов с темным центром. Они способны к репродукции, грамотрицательны, не чувствительны к пенициллину, размеры их от крупных (крупнее исходных форм) до очень мелких, меньших, чем некоторые вирусы.
К неклассифицированным вариантам с дефектами стенок относят все те формы микроорганизмов с нарушенной клеточной стенкой, которые не могут быть отнесены к описанным выше 4 типам. Таким образом, эти авторы в известной мере подтверждают высказанное выше Минхом и Флеком мнение об условиях изменения бактерий. Таким образом, из приведенных сообщений можно предположить, что колебания изменчивости микроорганизмов, связанной с нарушением оболочки, зависят главным образом от условий среды, в которой они обитают.
Кроме того, приведенные данные косвенно могут указывать на близость или идентичность L-форм бактерий с плевропневмонийноподобными микроорганизмами (микоплазмами). Об этом говорят многие авторы (В. С. Левашов, 1966; С. В. Прозоровский, 1970; Г. М. Бочко и др., 1968; Л. Дин, 1962; В. Д. Тимаков, Г. Я. Каган, 1965, 1973), что в большей степени расширяет и усложняет классификацию очень подвижного свойства изменчивости микроорганизмов.
Помимо неклассифицированных вариантов с дефектом клеточной стенки, Туланс (Tulanse, 1951) указывает на наличие мегаломорфных форм. Сюда были отнесены очень сильно увеличенные клетки, образующиеся в культурах бактерий, находящихся в неблагоприятных условиях. Эти формы образуются под влиянием различных солей (К, Na, Zi, Ca, Mg и др.), а также под воздействием антибиотиков и бактериофагов. Они не способны к длительному существованию, как и гетеротрофные (неклассифицированные) формы.
В. Д. Тимаков и Г. Я. Каган (1973) считают, что различные воздействия на бактерии вызывают и различные ответные реакции. Часто в одной и той же популяции отдельные клетки могут реагировать различно на одно и то же воздействие. Поэтому в одной и той же культуре можно наблюдать клетки типа гетеротрофного роста, элементы L-форм и погибшие особи.
Первые сообщения об измененных вариантах бруцелл с нарушенной клеточной стенкой стали появляться в литературе сравнительно недавно.
Нелсон и Пиккет (Nelson a. Pickett, 1951) получили из крови человека микроорганизмы, сходные с L-формами и с шероховатой формой бруцелл. Посевы авторы делали из цитратной крови, предварительно промытой дистиллированной водой с целью удаления антител. В данном случае они получали сплошной рост культуры на поверхности агара, которая продолжала расти в течение нескольких дней, но субкультуры авторам не удалось получить. Эти культуры были очень полиморфны и состояли из кокков, палочек, цепочек, ветвящихся форм, промежуточных и инволюционных форм, а также гигантских клеток, характерных для L-форм. В пептическом пищеварительном бульоне ВТК-среды эти варианты давали рост в виде плевропневмонийноподобных форм (микоплазм). В той же среде, но и чашках с 0,7% агара они росли в виде крупных полиморфных форм.
Авторы получили L-формы из типических бруцелл при посевах их на среды, содержащие кровь человека. При этом они заметили, что на образование L-форм бруцелл влияют фаг, температура, позитивная противобруцеллезная сыворотка, пенициллин и другие вещества.
В своей предыдущей работе Нелсон и Пиккет (1951) отметили, что при использовании метода промывки нитратной крови или сгустков крови дистиллированной водой ими были получены варианты бруцелл, совершенно атипичные по характеристике колоний, но они имели общий антиген с Br. abortus. В этих культурах обнаруживался и бактериофаг.
Каррер и Ру (Karrere a. Roux, 1953) получили из первой субкультуры штамма Br. melitensis, свежевыделенного из крови больного, шаровидные тела пли, по терминологии авторов, «гигантские клетки». Эти шаровидные тела, по современной терминологии, не могут быть, по-видимому, отнесены к сферопластам. В пептонной воде, в которую добавлялись пенициллин и плазма крови человека с первых же часов культивирования (наблюдение проводилось через каждый час), появлялись отдельные увеличивающиеся в размерах клетки, превращающиеся в крупные шаровидные тела, имеющие в диаметре размер до 5—6 мкм.
К 20-му часу от начала культивирования в препаратах наблюдались только эти формы. Через 48 ч в осадке появлялись шаровидные тела разного объема от 5 до 50 мкм в диаметре. Здесь же, т. е. в шаровидных телах, обнаруживались мелкие формы — «тонкие грануляции» — и происходила вакуолизация. Такие формы отнесены авторами к L-формам бруцелл. Все шаровидные тела под воздействием пенициллина или пенициллина и плазмы крови человека воспроизводили L-формы бруцелл. Авторы сообщают, что шаровидные тела в среде Альбнмп реверсировали путем воспроизведения мелких коккобациллярных форм.
Шаровидные тела, или сферопласты, сравнительно легко могут быть получены из культур разных видов бруцелл, и поэтому указанной форме измененных бруцелл в литературе, уделено больше места, чем другим.
Хайнс, Фрнман, Пирсон (Hines, Freeman, Pearson, 1964) изучали глициновые и пенициллиновые сферопласты бруцелл. Они при этом установили, что эндотоксин в клеточной стенке бруцелл отсутствует, но отмечается иммунологическая активность сферопластов против антисыворотки клеточной стенки.
Глицино-пенициллиновые сферопласты бруцелл лишь в небольшом проценте, а пенициллиновые до 25% реверсировали в исходную форму. Кроме того, указанные комбинированные сферопласты не адсорбировали бруцеллезного фага, тогда как пенициллиновые и глициновые сферопласты в незначительной степени, но все же его адсорбировали.
Сферопласты бруцелл авторами были получены в жидкой среде, основу которой составлял стерильный триптозный бульон, содержащий 0,2 мг сахарозы. Для получения пенициллнновых сферопластов к жидкой среде добавляли пенициллина 1,5 ЕД на 1 мл; для получения глициновых сферопластов к ней добавляли 2% глицина. Культуры Br. suis штамма 32, Br. abortus штаммов 2308 и 1279, Br. melitensis штамма 2452 вводили в среду в концентрации до 1—2-10-9.
Для изучения отношения культуры бруцелл к фагу последнюю брали в той же концентрации, что и в предыдущем случае, но б бульоне Альбпми с 0,2 мг сахарозы.
Фриман и Румак (Freeman a. Rumack, 1964) при помощи методики радиоактивного излучения установили, что сферопласты, полученные из нормальных Br. suis (см. выше), поглощаются, как и измененные клетки Br. suis, моноцитами из перитонеального экссудата морской свинки.
Моноциты же под воздействием сферопластов разрушаются. При этом живые сферопласты, приготовленные из шероховатых форм бруцелл, разрушают моноциты более выраженно, чем сферопласты гладких бруцелл, а у сферопластов, убитых формалином, цитопатогенное действие не было обнаружено. Однако авторы сообщают, что реверсия (в определенных условиях) была воспроизведена не у всех типов сферопластов.
Об образовании L-форм бруцелл в культуре ткани почки хомяка сообщили Хаттен и Сулкин (Flatten a. Sulkin, 1966). Тканевая культура почки хомяка, инфицированная культурой Br. abortus штамма 3183, содержалась от 1 до 14 дней в различных концентрациях антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, тетрациклин). Особенно заметной разницы индуцирующей активности пенициллина и стрептомицина не отмечено. В течение первого дня было получено наибольшее количество измененных вариантов клеток в концентрации 2,5 и 5 ЕД на 1 мл как пенициллина, так и стрептомицина.
Как указывают Барнл, Вагучи, Эвелин (Barile, Vaguchi, Evelyn, 1962), культуры, относящиеся к L-формам, на среде BVE с добавлением 15% человеческой крови вырастали в виде микроколоннй. Колонии также появлялись через 48—72 ч на кровяном агаре, содержащем пенициллин. Получить субкультуру пз этих колоний не удалось. Реверсия наступала в течение 5—7 дней. В дальнейшем реверсированные варианты культивировались на плотном агаре в чашках.
Ру и Сассин (Raux a. Sassine, 1971) полученные ими под воздействием пенициллина сферопласты Br. melitensis относят по современной классификации к стабильным L-формам бруцелл типа С. Колонии L-форм Br. melitensis в отличие от L-колоний большинства других видов бактерий не проявляются в классической морфологии, т. е. у них нет вдавленного темного центра и более светлого ореола на периферии (вид глазуньи из множества яиц). Колонии были в диаметре около 1 мм.
Христофоров, Пешков (Christophorov, Peshkov, 1969) получили неустойчивые L-подобные образования в культурах бруцелл на глицериновом агаре с жидкостью Хенкса, к которой добавляли бычью сыворотку, пенициллин и глицин.
Н. Н. Островская, П. А. Вершилова, П. А. Толмачева (1972) получили измененные варианты патогенных бруцелл на искусственной среде с добавлением пенициллина. В полужидкой среде клетки представлялись шаровидными разной величины. При пересеве на плотный агар в бактериологические чашки колонии вырастали плоские, мелкие.
Приведенные выше литературные данные по изменчивости бруцелл, в особенности L-форм бруцелл, имеют важное значение в связи с регистрацией случаев патологии, вызываемой этими измененным» вариантами у животных и людей.
В. Д. Тимаков (1970), ссылаясь на работы Г. Я. Каган, В. С. Левашова, С. В. Прозоровского, Е. И. Коптелова, А. Г. Щеглова, В. Т. Савенкова и других авторов, посвященные изучению L-форм, микоплазм и прочих генетически измененных форм бактерий, указывает на то, что эти микроорганизмы играют существенную роль в этиологии и патогенезе ревматизма, септического эндокардита, в заболеваниях мочеполового тракта, в респираторных заболеваниях и в ряде сложных воспалительных заболеваний человека, животных и птиц.
Способность L-вариантов к реверсии, их длительная персистенция в организме, резистентность к индуцирующим факторам дает основание считать, что L-варианты обусловливают возникновение рецидивов при инфекционных заболеваниях, а в некоторых случаях являются источниками инфекции в эпидемическом процессе.