Второй белковый компонент клейковины — Глютенин, относится, как известно, к группе глютелинов, т. е. белков, растворяемых в разбавленных щелочах. Основной метод выделения
Глютенина в виде очищенного препарата, предложенный Осборном, состоит в экстрагировании муки или клейковины 0,2%-ным раствором едкого калия (или едкого натрия) после предварительного полного извлечения глиадина 60—70%-ным этиловым спиртом. Щелочные экстракты фильтруют и осаждают глютенин, нейтрализуя щелочь соляной кислотой. Осадок глютенина промывают водой и 70%-ным спиртом (для удаления возможной примеси глиадина), вновь перерастворяют в 0,2%-ной щелочи и повторно осаждают кислотой.
Обезвоживание глютенина проводят так же, как и глиадина, т. е. обрабатывают сырой препарат возрастающими концентрациями спирта и серным эфиром до получения сухого порошка, содержащего около 17,5% азота (по Осборну— 17,49%).
Нужно сказать, что еще Осборн отмечал неопределенность состава щелочнорастворимых белков, считая, что сама методика их выделения не гарантирует чистоты получаемых препаратов, поскольку к глютелинам примешиваются остатки всех других белков, не извлеченных полностью соответствующими растворителями или частично денатурированных ими.
Часть этих белков могла находиться, например, в невскрытых клетках или входить в состав сложных комплексов с танинном, нуклеиновыми кислотами и т. п., а затем под действием
Щелочи переходить в раствор и примешиваться к истинным глютелинам. Позднее было показано (Dill, Alsberg, 1925; Gottenberg, Alsberg, 1927; Кизель, Новиков и Сухоруков, 1931), что при извлечении глиадина определенные концентрации спирта частично денатурируют этот белок и растворимость его уменьшается. Это может приводить к неполному выделению глиадина и загрязнению препаратов глютенина, получаемых при последующем экстрагировании материала щелочью, переходящими в щелочной раствор остатками денатурированного глиадина.
Между препаратами глютенина получаются очень заметные различия, если изменять методику выделения и очистки этого белка (Blish, 1925, 1926, 1927, 1929; Blish, Abbot, Platenius, 1927). Щелочь, как известно, оказывает на белки заметное денатурирующее действие (разрушение амидов и цистина, превращение аргинина в орнитин и мочевину, рацемизация и т. д.) и потому глютенин, по-видимому, всегда является значительно измененным по сравнению с его первоначальным состоянием до выделения из клейковины или муки.
Варьируя методику выделения и очистки глютенина, можно изменять степень денатурации исходного белка и получать препараты, заметно различающиеся но составу и свойствам. Так, Блиш и Сандстедт (Blish, Sandstedt, 1929) показали роль зависимости от концентрации применяемой щелочи получаютсяся препараты глютенина, неодинаковые по содержанию азота и азота оснований.
Многие исследователи пытались избежать денатурации глютенина, применяя для его выделения не щелочь, но другие растворители, например разбавленную уксусную кислоту или водный раствор мочевины. Так, по методу Блиша и Сандстедта (Blish, Sandstedt, 1929) сырую клейковину диспергируют в 0,07—0,10 п уксусной кислоте, добавляют метиловый спирт до концентрации 60—70% и, удалив крахмал центрифугированием, осаждают глютенин путем нейтрализации раствора щелочью до слабо кислой реакции. Процедуру выделения повторяют 2—3 раза, а затем обезвоживают белок спиртом и эфиром.
Кук и Алсберг (Cook, Alsberg, 1931) предложили выделять глютенин, диспергируя сырую клейковину в 30%-ном водном растворе мочевины и осаждая затем глютенин (после удаления крахмала в суперцентрифуге) сернокислым магнием (0,17 от насыщения), этиловым или метиловым спиртом (до концентрации 60—70%) или разбавлением водой. Глиадин в этих условиях остается в растворе.
В результате применения описанных методов получались препараты, заметно отличающиеся от обычного глютенина как по химическому составу, так и по физическим свойствам. В качестве примера приведем данные Лармура и Соллеиса (Larmour, Sallans, 1932, цит. по Bailey, 1944) по аминокислотному составу пяти препаратов глютенина, полученных из одного и того же материала.
Следует отметить, что при выделении глютенина даже без применения щелочи белок подвергается все же некоторой денатурации вследствие действия спирта, которым, во-первых, предварительно извлекают из материала глиадин, а, во-вторых, очищают и обезвоживают глютенин с целью получения его в виде сухого препарата. Денатурирующее действие спирта па глютенин было отчетливо показано Куком и Алсбергом (Cook, Alsberg, 1931), в опытах которых глютениновая фракция клейковины полностью теряла способность пептизироваться 30%-ным водным раствором мочевины после предварительного экстрагирования клейковины спиртом. Сырые препараты глютенина, полученные путем высаливания из дисперсии клейковины в растворе мочевины, также утрачивали свою растворимость после обезвоживания их спиртом. Несомненно, все же, что методы выделения глютенина из пшеничной муки или клейковины, в которых не применяется непосредственное извлечение этого белка щелочью, более предпочтительны, чем классический метод Осборна, вследствие меньшей денатурации глютенина. Особенно ярко это было продемонстрировано недавно И. Ш.Шкловским (1957), которому впервые удалось получить «синтетическую клейковину» путем замешивания с водой смеси сухих препаратов глиадина и глютенина пшеницы. Попытки приготовить «синтетическую клейковину» многократно предпринимались и ранее (см. подробнее ниже), но не имели успеха, так как глютенин, выделенный по Осборну, был денатурирован щелочью и не вступал во взаимодействие с глиадином. И. Ш. Шкловский применил для получения глютенина метод Блиша и Сандстедта, т. е. выделил этот белок из сырой клейковины путем экстрагирования ее 0,01-нормальной уксусной кислотой с последующей нейтрализацией кислого раствора глютенина щелочью до момента выпадения его в изоэлектрической точке. Полученный таким образом препарат глютенина оказался пригодным для приготовления «синтетической клейковины», т. е. он не был денатурирован в той степени, как глютенин, выделенный методом Осборна с применением щелочи.
В последнее время Вальдшмидт-Лейтц и Миндеман (Wald-schmidt-Leitz, Mindemann, 1957) разработали новый метод получения глютелинов пшеницы, ржи и ячменя без применения щелочи. Муку экстрагируют вначале 70%-ным этамолом для удаления проламинов, а затем извлекают глютелины 60%-ным изопропанолом, содержащим 0,2% бисульфита натрия. После отделения остатка муки к раствору добавляют изопропиловый спирт до концентрации 90%, причем глютелины выпадают в осадок. Процедуру выделения повторяют дважды, промывают белок 70%-ным этанолом и освеживают обычным способом возрастающими концентрациями спирта, эфиром и окончательно в вакуумном пространстве. Авторы не приводят данных по сравнению препаратов глютенина, полученных предложенным ими методом и обычно применяемыми методами Осборна или Блиша и Сандстедта, так что в настоящее время трудно судить о достоинствах и недостатках новой методики; можно только отметить, что по аминокислотному составу глютенин, выделенный с помощью изопропилового спирта, сильно отличается от глютенинов, получаемых другими методами.
Для характеристики химического состава глютенина пшеницы приведем данные различных авторов по содержанию в нем общего азота и отдельных аминокислот.
Как видно из представленных данных, содержание азота колеблется в разных препаратах глютенина сильнее, чем это наблюдается для глиадина (табл. 17), что объясняется большими трудностями выделения и очистки щелочнорастворимых белков по сравнению с проламинами. Трудность выделения и очистки глютенина, а также невозможность растворения его в нейтральных растворителях привели к тому, что этот белок исследован вообще, гораздо меньше, чем глиадин. В литературе, например, почти отсутствуют данные по аминокислотному составу глютенина, полученные современными методами. Результаты некоторых определений аминокислотного состава глютенина, но все они, за исключением данных Вальдшмидт-Лейтца и Миндеман, получены давно, по недостаточно точной и уже устаревшей методике. Колебания в аминокислотном составе отдельных препаратов глютенина зависят от тех же факторов, которые были подробно рассмотрены выше по отношению к глиадину. Различия, наблюдаемые в составе глютенинов, выделенных из одного и того же материала с использованием разной методики (по Лармуру и Солленсу).
Обращает внимание большая разница в аминокислотном составе глютенинов, выделенных старыми методами и новым способом Вальдшмидт-Лейтца и Миндеман. Последние авторы определяли аминокислотный состав глютенина наиболее точным из современных методов — хроматографией па колонках крахмала, вследствие чего полученные ими результаты представляются весьма достоверными. Однако сравнивать эти результаты, строго говоря, не с чем, так как все прочие данные получены другими методами и на ином материале. Было бы интересно сопоставить аминокислотный состав глютенинов, выделенных одним и тем же методом из пшениц разного сорта, выращенных в разных условиях, аналогично тому, как это сделано Н. М. Сисакяном и Л. С. Mapкосяном для глиадина, глобулина и альбумина пшеницы. К сожалению, по этим вопросам имеются только отрывочные старые данные Блиша (Blish, 1916), Кросса и Свейн, (Cross, Swain, 1924), а также А. Кизсля, В. Новикова и К. Сухорукова (1931), не наблюдавших заметных различий в распределении азота по Ван-Слайку в препаратах глютенина, выделенных из пшениц разных сортов и разного хлебопекарного качества. В то же время Лармур (Larmour, 1927), сравнив аминокислотный состав глютенинов, выделенных по Осборну из пяти видов рода Triticum: Tr. vulgare, Tr. durum, Tr. spelta, Tr. dicoccum и Tr. monococcum, констатировал определенные различия в содержании исследованных им аминокислот и азотсодержащих фракций (по Ван-Слайку). Известные различия между глютелинами разных злаков существуют и в отношении их физико-химических свойств, например растворимости, как это недавно было показано Н. А. Тиуновой (1959, I960) на примере глютелинов пшеницы, пырея и пшенично-пырейного гибрида.
Значительные колебания отмечены в литературе и относительно положения изоэлектрической точки глютенина пшеницы, определявшейся разными авторами на препаратах этого белка неодинакового происхождения и в неодинаковых условиях.
Подводя итоги всему изложенному, следует сказать, что имеется мало оснований считать глютенин пшеницы определенным белком с известным химическим составом и физико-химическими свойствами. Правильнее, по-видимому, говорить о глютениновой фракции клейковины, состоящей, в зависимости от особенностей пшеницы и методики выделения, из отличающихся друг от друга белков, объединяемых общим названием «глютенин» по общему для них признаку растворимости в разбавленной щелочи. Кроме того, каждый из глютенинов, выделяемых из пшеницы, не является гомогенным химически индивидуальным белком, но может быть разделен на фракции, аналогично тому, как это было рассмотрено выше в отношении глиадина выше в конце прошлого столетия Флеран, осадив глютенин путем насыщения углекислотой спиртощелочного экстракта клейковины, получил дополнительный осадок белка после подкисления фильтрата серной кислотой. Этот третий компонент клейковины был назван автором конглютином. Количество его составляло от 2 до 8% от веса исходной клейковины и он представлял собой, очевидно, наиболее растворимую фракцию глютенина. Гальтон (Halton, 1924) провел постепенное осаждение глютенина кислотой из щелочного раствора и получил две фракции белка, отличавшиеся друг от друга по удельному вращению (—82,5° и —78°С) и по кривым рацемизации. Однако проверка этих опытов, предпринятая Блишем (Blish, 1925), не подтвердила результатов Гальтона, так как оказалось, что фракционирование глютенина удается после рацемизации его щелочью.
В 1927—1332 гг. появилась сепия работ Ксонка и Джонса (Csonka, 1927, 1932; Csonka, Horn, 1931; Csonka, Jones, 1927, 1929; Jones, Csonka, 1927, 1928) о фракционировании глютелинов различных злаков — пшеницы, овса, ржи, ячменя, риса и кукурузы — путем осторожного высаливания щелочных растворов белка небольшими количествами сульфата аммония.
Было показано, что глютенин пшеницы состоит из двух фракций, названных авторами а — и р-глютелинами. а-глютелин осаждается из щелочного раствора клейковины, предварительно полностью освобожденной от глиадина, при добавлении сульфата аммония до концентрации 0,018—0,020 от насыщения. Дальнейшее добавление к фильтрату сульфата аммония до 0,16—0,18 от насыщения приводит к осаждению р-глютелина. Оба глютелина были очищены переосаждением, обезвожены и получены в виде сухих препаратов, и-глютелин содержал 17,14% азота; (3-глютелин — 16.10%. По аминокислотному составу обе фракции сказались различными.
Результаты исследования других злаков показали, что глютелины кукурузы и ячменя состоят из двух фракций, тогда как в зерне риса, овса и ржи удается обнаружить лишь один щелочнорастворимый белок, неподдаюшиися дальнейшему фракционированию.
Подводя итоги, можно сказать, что глютелин пшеницы, аналогично глиадину, нельзя рассматривать как гомогенное химически индивидуальное белковое вещество, идентичное во всех образцах клейковины.
По всем данным, глютенин представляет собой лишь гетерогенную, в той или иной мере денатурированную, фракцию клейковины, состав и свойства которой определяются в значительной степени методикой, применяемой для выделения этой фракции из общего комплекса клейковины.