Факультет

Студентам

Посетителям

Жизнеспособность замороженных тканей селезенки и костного мозга млекопитающих

Перед исследователями открылись новые перспективы, когда было установлено, что мыши, облученные летальными дозами рентгеновских лучей, выжили после имплантации им в брюшную полость здоровой ткани селезенки.

Облученные мыши и морские свинки выздоравливали также после внутривенного введения взвеси гомологичного костного мозга. Особый интерес вызвал тот факт, что мыши после облучения летальной дозой выживали при введении им костного мозга морской свинки или крысы. На первых порах казалось невероятным, чтобы гомотрансплантаты, а тем более гетеротрансплантаты костного мозга приживали. Возникло предположение, что защитным агентом служило какое-то гормональное или гуморальное вещество, содержащееся в селезенке и костном мозге.

Другие данные заставляли предполагать, что живые клетки донора выживают в организме облученного реципиента и обусловливают выздоровление последнего. Активный агент в селезенке и костном мозге утрачивает свою активность при хранении в течение нескольких часов при комнатной температуре или в течение 48 час при температуре +4 или —15°. Неорганические частицы и различные биохимические соединения в таких условиях могут сохранять свою специфическую активность, тогда как большая часть живых клеток погибает. В то же время клетки выживают, если ткань селезенки предварительно охладить до —79° и выдерживать при этой температуре в среде, содержащей глицерин. Барнс и Лутит измельчали селезенку мышей линии СВА в сыворотке, содержащей 15% (по объему) глицерина, и разливали полученную взвесь в ампулы, которые затем медленно охлаждали, применяя ту же методику, что и при охлаждении сперматозоидов быка и ткани яичников. Спустя 2—17 дней ампулы отогревали, а их содержимое гомогенизировали и вводили мышам, которых не более чем за 1 час до инъекции облучали летальной дозой 950 г. Многие животные оставались живы спустя 30 дней после облучения и введения охлажденной и хранившейся при температуре —70° взвеси, эквивалентной по количеству ткани целой селезенки. Когда количество вводившейся ткани сократили до 1/5 объема селезенки, число выживших мышей (как контрольных, получавших свежую ткань, так и подопытных, которым вводили замороженную ткань) уменьшилось. В других опытах материал хранили при температуре —70° в течение 83 дней до инъекции его мышам, облученным летальной дозой 950 г. Спустя 28 дней 4 мыши из 5, получивших количество ткани, эквивалентное 1 селезенке, и 3 мыши из 5, получивших 1/5 селезенки, были еще живы.

Результаты других опытов также подтвердили участие живых клеток в процессе защиты животных от облучения. Так, предварительная инъекция (до облучения) клеток селезенки от мыши другой линии, вызывающая иммунологическую реакцию, полностью уничтожала терапевтический эффект второй инъекции (после облучения) клеток селезенки мыши той же линии. Когда проводили одну инъекцию гомологичных клеток после облучения, собственные и искусственно вызванные антитела донора не исчезали и содержание антител в крови реципиента, по-видимому, увеличивалось.

Была найдена такая линия мышей (T6), у которых во время метафазы делящихся клеток костного мозга выделялась особая пара хромосом. В результате этой аномалии, обусловленной неадекватной реципрокной транслокацией двух самых маленьких членов нормального набора хромосом, животные были гетсрозиготами. Взвешенные клетки селезенки от мышей линии Т6 вводили мышам линии СВА, облученным летальной дозой. Спустя 5— 49 дней после инъекции облученных животных забивали и их костный мозг подвергали цитологическому исследованию. В каждом случае в клетках костного мозга во время митоза была обнаружена характерная хромосома мышей линии Т6. Полученные результаты показывают, что клетки донора заменили большую часть клеток костного мозга реципиента. Таким образом, не оставалось никаких сомнений в том, что клетки селезенки, обработанные глицерином и хранившиеся при —70°, выжили и «заселили» костный мозг и другие ткани облученных животных, которым эти клетки были введены. Нормальная иммунологическая реакция со стороны реципиента на введение гомологичной ткани была, по-видимому, подавлена в результате вызванного ионизацией повреждения тканей и клеток, обычно вырабатывающих антитела.

Хромосомы крысы отличаются от хромосом мыши как по форме, так и по величине. Когда мышам, получившим летальные дозы рентгеновских лучей, вводили взвеси только что взятых у крыс клеток костного мозга, через 5, 11 и 19 дней в их костном мозге можно было обнаружить делящиеся клетки, причем хромосомы имели конфигурацию, типичную для хромосом крысы. Из 1400 клеток, исследованных во время митоза, ни в одной не было найдено хромосом с конфигурацией, типичной для мыши. В этом случае иммунологическая реакция на гетерологичные клетки была устранена облучением у реципиента клеток, которые в обычных условиях вырабатывают антитела. Позднее Барнс вводил мышам, облученным летальной дозой, костный мозг крысы, который он предварительно обрабатывал глицерином, охлаждал до —79° и хранил при этой температуре в течение 2—83 дней. Выживших мышей забивали спустя 40 и 360 дней после облучения. У 4 животных из 6 при обследовании костного мозга и других тканей были отчетливо видны крысиные клетки.

Феррби и его сотрудники показали, что доза обработанного глицерином замороженного костного мозга, необходимая для сохранения жизни мышам, облученным летальной дозой и обреченным на гибель в течение 30 дней после облучения, сравнима с дозой свежего незамороженного костного мозга, применяемой в подобных же случаях. Эти авторы подсчитывали общее число ядерных клеток в материале, предназначенном для инъекции, однако такой подсчет не всегда служил адекватным критерием «ценности» костного мозга донора. Феррби и сотрудники испытывали также различные методы замораживания и оттаивания костного мозга мыши и проверяли жизнеспособность клеток по эффективности их защитного действия на мышей, облученных летальной дозой рентгеновских лучей. Оказалось, что быстрое замораживание снижало жизнеспособность как предварительно обработанных, так и не обработанных глицерином клеток донора. Зато при медленном охлаждении по методу Полджа и Лавлока материал, предназначенный для инъекции, прекрасно сохранялся независимо от содержания в среде 5—15% глицерина или полного отсутствия его. В клетках костного мозга, обработанных глицерином, при перемещении их в лишенную глицерина среду in vitro наступал лизис. Тем не менее при введении таких клеток облученным животным они все же предотвращали их гибель. В то же время осмотический лизис можно было предупредить, понижая концентрацию глицерина по методу Словитера. Результаты показывают, что костный мозг прекрасно сохранялся в продолжение не менее 6 недель при температуре —80°, судя по его защитному действию при введении облученным животным.

Функциональную активность замороженных клеток костного мозга мыши и человека проверяли также по их способности после оттаивания синтезировать in vitro дезоксирибонуклеиновую кислоту. Применяли методику Томаса и Локта. Поскольку синтез ДНК неразрывно связан с процессом размножения клеток, результаты исследования, вероятно, служили хорошим показателем числа жизнеспособных клеток. Как видно из результатов клетки костного мозга мыши в меньшей степени, чем клетки человека, повреждаются при обработке 15-процентным раствором глицерина и замораживании. Эти результаты позволяют предполагать также, что при любом методе замораживания костного мозга погибает довольно много клеток. Наиболее благоприятной средой для выживания клеток, охлажденных до —80°, судя по их способности синтезировать ДНК после оттаивания, служила смесь, содержащая 15% глицерина и сыворотку или альбумин. Когда перед опытом после оттаивания постепенно удаляли глицерин, результаты были еще лучше.

Костный мозг человека собирали от мертворожденных плодов и трупов взрослых, а также извлекали из резецированных ребер. Клетки костного мозга обрабатывали глицерином и вводили больным без каких-либо неблагоприятных последствий. Обработанный глицерином костный мозг трупов охлаждали до —80° и хранили при этой температуре несколько недель. Затем его оттаивали и вводили больным, которых в целях лечения лейкоза подвергли облучению большими дозами рентгеновских лучей, в результате чего они заболели апластической анемией. В одном случае последующее улучшение состояния больного позволило предполагать, что клетки костного мозга пережили замораживание и стали размножаться в организме реципиента.

Ранние исследования по трансплантации свежего и замороженного костного мозга облученным животным и человеку стимулировали дальнейшую разработку методик получения материала, а также введения и хранения тканей, взятых у плодов, неполовозрелых и взрослых животных и людей. Другие способы проверки выживаемости свежего или замороженного костного мозга включают культивирование ткани in vitro, изучение подвижности клеток и микроскопическое исследование препаратов после их окрашивания с целью дифференцировки живых и мертвых клеток. На основании полученных данных можно полагать, что повреждение клеток всегда происходит во время хранения костного мозга при низких температурах и что это связано, по крайней мере частично, с добавлением или удалением глицерина. Миелоидные клетки, по-видимому, повреждаются сильнее, чем молодые клетки эритроцитарного ряда. Тем не менее костный мозг, обработанный глицерином, медленно охлаждавшийся до —79° и хранившийся при этой температуре, также способствует выздоровлению после облучения.

Непосредственный и отдаленный эффекты имплантации, а также дальнейшую судьбу ауго-, гомо — и гетеротрансплантатов свежего и замороженного костного мозга интенсивно изучали не только на мышах и людях, но и на крысах, кроликах, собаках и других животных, получивших разные дозы рентгеновских лучей как в здоровом состоянии, так и при различных заболеваниях. Посвященная этому вопросу обширная литература в основном рассмотрена в обзорных статьях. Одна из основных трудностей заключается в том, что животные, получившие смертельную дозу облучения, а затем как будто бы излеченные с помощью трансплантации свежего или замороженного гомологичного костного мозга, через 3—4 месяца погибают от «вторичной болезни». На основании имеющихся данных можно полагать, что их гибель обусловлена иммунологической реакцией хорошо приживших клеток трансплантата против клеток и тканей реципиента. Эта вторичная болезнь может протекать в легкой форме в тех случаях, когда тканевая несовместимость между трансплантатом и реципиентом слабо выражена или когда используют незрелую миелоидную ткань. Так, введение костного мозга от одного близнеца другому оказалось очень эффективным при лечении тяжелого лейкоза, вызванного большими дозами облучения. В то же время введение гомологичного костного мозга (не от близнеца) больным, случайно подвергшимся облучению слишком большими дозами рентгеновских лучей, давало весьма сомнительный эффект.

В заключение можно сказать, что мы уже владеем методами сохранения жизнеспособности молодых клеток костного мозга всех трех типов путем обработки их глицерином, охлаждения и консервации при низких температурах. Однако эти методы требуют дальнейшего усовершенствования для увеличения числа жизнеспособных клеток после оттаивания и имплантации. Правда, ценность трансплантации костного мозга облученным животным и людям несколько снижается наличием иммунологических реакций, в частности антигенной реакции приживших клеток против тканей реципиента. Задача заключается в преодолении таких нежелательных реакций (без влияния в то же время на выработку организмом антител к различным бактериям, их токсинам и другим чужеродным белкам), причем решение этой задачи, вероятно, в еще большей степени не терпит отлагательства, чем задачи хранения костного мозга.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: