Факультет

Студентам

Посетителям

Жизнеспособность замороженной кожи млекопитающих

Более 150 лет прошло с тех пор, как Бароиио вырезал у овцы кусочки кожи во всю ее толщину и спустя определенные промежутки времени (до 1 час) успешно имплантировал их той же овце.

В конце XIX столетия Реверден, Оллье, Тирш и Волф сообщили о своих клинических случаях успешной аутотрансплантации кусочков кожи. Применявшиеся ими методы пересадки носят их имена. Мартин в 1873 г. одним из первых стал хранить кожу при температуре чуть выше нуля для последующей трансплантации. Он пришел к выводу, что охлаждение способствует сохранению жизнеспособности кожи in vitro, тогда как тепло дает отрицательный эффект. В 1903 г. Венчер выдерживал в стерильных условиях кусочки кожи при температуре +4° в течение 2 недель и при последующей аутотрансплантации обнаружил хорошее приживление большей части трансплантатов. Каррел показал, что наилучшей средой для хранения кожи при +4° служит вазелин. Уэбстер, широко применявший трансплантацию консервированной кожи, сообщил о 23 больных, которым 36 раз были имплантированы охлажденные кусочки их собственной кожи. Все трансплантаты, хранившиеся при +4° менее 21 дня, прижили. Хотелось бы, однако, добиться более продолжительного хранения замороженной кожи при очень низких температурах или после ее лиофилизации.

Между тем, изучая трансплантацию раковых и саркоматозных опухолей, Майдер и Мортон обнаружили, что клетки многослойного плоского эпителия в контрольных кусочках кожи переживали замораживание при —50 и —74° и последующее оттаивание. Во всех опытах нормальную или малигнизированную ткань имплантировали под кожу. Через 10 дней имплантаты извлекали, фиксировали, делали срезы и окрашивали их. В замороженной коже крысы образовывались видимые подкожные узелки, подобные образующимся при гомотрансплантации свежей кожи. Исследование под микроскопом показало, что выжившие клетки многослойного плоского эпителия образовали под кожей кисты, в которых обнаруживались волосы. Наличие митотических фигур свидетельствовало о размножении этих клеток. При медленном охлаждении клетки повреждались в меньшей степени и в трансплантатах наблюдалась более выраженная регенерация. К сожалению, в описываемых опытах не удалось выяснить, как будет функционировать замороженная кожа при трансплантации ее в обычное местоположение на поверхности тела.

Уэбстер удалял у больного участки кожи со следами татуировки и трансплантировал его собственную же кожу, быстро замороженную при —79°. Некоторые трансплантаты прижили, но большая часть их отторглась. Лучших результатов удалось добиться при аутотрансплантации лиофилизированной кожи.

Примерно в это же время Бриггс и Джанд разработали надежную методику аутотрансплантации кожи у экспериментальных животных, которая заключалась в следующем. На спине и на животе мыши вырезали одинаковые круглые кусочки кожи диаметром 9,5—10 мм. Кожу со спины пришивали на животе и наоборот. Перед закреплением трансплантата его поворачивали под углом 45—180°, а затем покрывали кусочком целлофана и накладывали вокруг туловища животного полоску лейкопластыря. Через 5 дней обследовали трансплантаты и снимали швы. Трансплантаты всегда приживали, хорошо васкуляризировались и в последующие несколько недель прорастали шерстью. По длине и направлению роста волос их можно было отличить от окружающей кожи. Опыты повторили, используя кожу, замороженную приблизительно при —79°. В первых опытах кусочки кожи с живота мыши помещали на увлажненной рингеровским раствором полоске фильтровальной бумаги во внутреннюю трубку двойной пробирки. Затем последнюю опускали в сосуд Дьюара, заполненный измельченной в порошок твердой углекислотой. В течение 1,75—2,2 мин температура кожи снижалась от 0 до —15°, а затем в течение незарегистрированного периода времени — от —15 до —78,5°. Спустя 1—12 час внутренние пробирки перемещали в водяную баню с температурой +30°, в которой образцы оттаивали приблизительно за 1 мин. Затем 18 мышам трансплантировали на спину кусочки их собственной кожи, причем б трансплантатов из 18 прижили.

Во втором опыте применяли ту же методику охлаждения, но круглые кусочки кожи с живота складывали таким образом, чтобы внутренняя поверхность кожи не соприкасалась с внешней средой. В результате кожа не контактировала с раствором Рингера и охлаждалась медленнее, так что температура снижалась от 0 до —15° за 2,5—3 мин. После пребывания в течение 1—6 час при температуре —78,5° кусочки оттаивали и трансплантировали на спину; 62% трансплантатов прижили. В третьем опыте кусочки кожи с живота охлаждали на льду и замораживали, как во втором опыте. Затем их быстро оттаивали, непосредственно поливая раствором Рингера с температурой 25°. Кусочки прикладывали, не пришивая, к области дефекта на спине животного; 78% трансплантатов прижили, и у них полностью восстановилась функциональная активность. Полученные данные окончательно показали возможность восстановления нормального функционального состояния кожи, замороженной при —79°, после трансплантации ее на поверхность тела живого животного. Они позволяют предполагать, что медленное охлаждение и быстрое согревание дают наилучшие результаты и что при внесении в эту методику небольших изменений можно будет получить еще более высокий процент приживления трансплантатов.

Еще в 1873 г. Конгейм показал, что охлаждение кожи у интактного животного вызывает ее повреждение. Так, ушные раковины кролика, замороженные при —7 или —8°, распухали, при —10 или —16° воспалялись, а при —18 или —20° наступал некроз. Согласно Лейку, кожа человека как in situ, так и в виде лабораторных препаратов переносит без ущерба замораживание при —6°, но не при более низкой температуре. Следует отметить, что приведенные данные находятся в резком противоречии с результатами, полученными другими исследователями. Крейбергу и сотрудникам удалось показать, что при замораживании и оттаивании кожи на поверхности тела в подкожных кровеносных сосудах наступает стаз, приводящий к отеку, полному прекращению местного кровообращения и в конечном счете — некрозу. Гибель замороженной непосредственно на теле кожи не обусловлена гибелью отдельных клеток. При замораживании у интактных мышей ушных раковин при —79 или при —190° во всех случаях наступал некроз кожи и стаз в подкожных сосудах. В противоположность этому лоскуты замороженной кожи, вырезанные вскоре после оттаивания и трансплантированные

в подкожный карман на боку у того же животного, приживали, причем формировался многослойный эпителий. Выживаемость эпителия понижалась по мере увеличения промежутка времени между оттаиванием ушной раковины, с одной стороны, и вырезанием и трансплантацией кожи — с другой.

Кожный покров млекопитающих представляет собой исключительно сложную систему тканей, которая состоит из дермы с сальными и потовыми железами, окруженными сложными сплетениями коллагеновых и эластических волокон многослойного плоского эпителия, а также придатков — волос и ногтей (когтей). Толщина многослойного плоского эпителия, степень кератинизации и пигментации, так же как и рисунок кожи, зависят от расположения сосочков в нижележащей дерме и характерны для кожи в любом участке тела. Функциональное выживание кожных трансплантатов можно определять не только по росту многослойного плоского эпителия, но и по его цвету, по рисунку кожи и толщине кутикулы на его поверхности. Рост, структура, цвет и направление волос, наличие сальных и потовых желез также служат показателем восстановления функциональной активности трансплантата. Кроме того, на хорошее состояние трансплантатов во всю толщу кожи может указывать и анатомическое расположение коллагеновых и эластических волокон в дерме, васкуляризация кожи, а также число и типы различных клеток.

Биллингэм и Медавар подробно изложили основные положения, касающиеся трансплантации свежей ткани у животных, описали различные методики и внешний вид приживших и неприживших трансплантатов через различные сроки после трансплантации. В своих опытах они применяли эти методики и пользовались разными показателями для определения выживаемости различных компонентов кожи, замороженной при низких температурах. Для замораживания и трансплантации использовали пигментированную кожу ушной раковины взрослого кролика. Каждый трансплантат представлял собой плоский кружок кожи диаметром 9 мм и толщиной 0,25—0,5 мм, так что в нем сохранялась большая часть волосяных фолликулов. Кусочки кожи замораживали и оттаивали с помощью различных методик и трансплантировали в область дефекта на боковой поверхности груди животного, у которого брали кожу. Одновременно с замороженной тканью всегда трансплантировали кусочек свежей кожи, не подвергшейся никакой обработке.

Перед замораживанием кусочки кожи пропитывали в течение 1 час при комнатной температуре раствором Рингера или же раствором Рингера с добавлением 15% (вес/объем) глицерина. Затем их помещали на смазанную вазелином полоску медной фольги внутренней поверхностью наружу. Некоторые кусочки замораживали быстро, погружая медную полоску в баню с изопентаном, охлажденным в жидком воздухе до температуры ниже —150°. Другие замораживали медленно, помещая медную пластинку во внутреннюю трубку двойной пробирки, причем расстояние между внутренним и внешним сосудами равнялось 3 мм. Эту двойную пробирку охлаждали в течение 15 мин в замораживающей смеси из спирта и углекислоты до —79°, после чего помещали на 15 мин в баню с жидким воздухом при температуре — 190°. В заключение медную полоску с кусочками кожи извлекали из пробирки и погружали в изопентан. Несколько кусочков кожи быстро согревали, погружая медную полоску в мензурку с раствором Рингера, нагретым до +37°. Остальные кусочки согревали медленно, для чего медную полоску переносили в пустой сосуд, обложенный битым льдом. В этом случае на оттаивание кожи требовалось не менее 5 мин. После этого кусочки кожи трансплантировали тем же животным, у которых они были иссечены. Для того чтобы выявить выживаемость различных компонентов кожи, опытные и контрольные трансплантаты обследовали и сравнивали сначала на 8-й день после трансплантации, а затем каждые 4 дня. Выживание клеток мальпигиевого слоя подтверждалось развитием нормального эпителия, а меланобластов — пигментацией поверхностного эпидермиса и возобновлением роста пигментированных волос. На сохранность нормальной фиброзной структуры дермы указывала отчетливая граница между окружающей тканью и трансплантатом, который сохранял характерный для кожи ушной раковины вид, а также плотность покрывающего его волосяного покрова и направление роста волос. При нарушении фиброзной структуры дермы центральная часть трансплантата выглядела мертвой, белой и постепенно уменьшалась в объеме, а волосяной покров сильно редел. Полученные результаты показывают, что эпителиальные клетки интактной кожи, обработанной раствором Рингера, переживали как быстрое, так и медленное замораживание при условии быстрого оттаивания. В присутствии 15% глицерина эпителий интактной кожи переживал и быстрое и медленное оттаивание. В то же время меланобласты кожи ушной

раковины кролика не переживали быстрого замораживания в растворе Рингера независимо от скорости оттаивания. Они погибали также при медленном оттаивании в присутствии 15% глицерина. В трансплантатах кожи, обработанных 15-процентным раствором глицерина и медленно охлажденных, не обнаруживалось никаких повреждений после хранения их в течение 4 месяцев при температуре —79° при условии быстрого оттаивания. По внешнему виду они не отличались от кусочков свежей кожи, трансплантированных в одно с ними время. Качество трансплантатов, обработанных раствором Рингера, всегда было ниже. Кожа сморщивалась и утрачивала вид, характерный для кожи ушной

раковины. Например, волосяной покров становился очень редким и частично или полностью исчезали пигментация. В последующих опытах Биллингэм обнаружил, что трансплантаты кожи, предварительно обработанной глицерином, медленно охлажденной до —79° и хранившейся при этой температуре более одного года, не отличались от пересаженных в одно время с ними трансплантатов свежей кожи. С тех пор кожу хранили в течение 4 лет при —79° без какого-либо ущерба для ее физиологических свойств. Были подготовлены также взвеси эпидермальных клеток, содержащие как клетки мальпигиева слоя, так и меланобласты. Эти взвеси замораживали, быстро сливая их по капле в тонкостенную пробирку и вращая последнюю под определенным углом в жидком воздухе. Другие пробы клеточной взвеси медленно охлаждали в двойной пробирке, погруженной в жидкий воздух, после чего внутреннюю пробирку погружали в жидкий воздух. Затем пробы быстро согревали, перенося пробирки в водяную баню с температурой +37°. Клеточную взвесь центрифугировали, компактную массу эпителиальных клеток отбирали пипеткой и трансплантировали в область дефекта. О выживании клеток мальпигиевого слоя судили по регенерации эпителиального слоя, а о наличии живых меланобластов — по пигментации этого слоя. Эпителиальные клетки, взвешенные порознь в растворе Рингера, не переживали ни быстрого, ни медленного замораживания, тогда как клетки мальпигиевого слоя и меланобласты переживали как быстрое, так и медленное замораживание при условии присутствия в среде 15% глицерина и быстрого оттаивания.

Хемфилл и Браун испытывали влияние 15-процентного раствора глицерина на выживаемость толстых (во всю толщу кожи) и тонких трансплантатов кожи мыши. Они подтвердили данные Биллингэма и Медавара, согласно которым выживаемость трансплантатов повышается при обработке глицерином, медленном охлаждении и быстром согревании. В то же время Кили и др., трансплантируя кожу собаки после охлаждения до —196° и оттаивания, получили лучшие результаты при сверхбыстром охлаждении, чем при замораживании кусочков кожи, помещенных в сосуд Дьюара на расстоянии 2—3 см от поверхности жидкого азота. Результаты, судя по доле приживших трансплантатов, были еще лучшими, когда кожу перед сверхбыстрым охлаждением от 20 сек до 3 мин обрабатывали этиленгликолем. При такой обработке и хранении в течение 46—66 дней при температуре —70° в 86% случаев отмечалось хорошее, стойкое приживление трансплантатов. Кили и др. (в соответствии с общепризнанной в то время теорией Люйета) предполагали, что этиленгликоль обезвоживал кожу, которая затем в процессе сверхбыстрого замораживания переходила в стекловидное состояние. Тейлор добился хороших результатов при быстром охлаждении кожи крысы, особенно в тех случаях, когда он предварительно обрабатывал ее этиленгликолем или глицерином. Возможно, разница в полученных результатах обусловлена видовыми различиями кожи собаки и крысы, с одной стороны, и мыши и кролика — с другой. В настоящее время общее мнение склоняется в пользу медленного охлаждения и предварительной обработки кожи глицерином или этиленгликолем.

За последние годы некоторые исследователи при изучении влияния глицерина и других многоатомных спиртов, а также процессов замораживания и оттаивания на клетки многослойного плоского эпителия кожи человека и животных применяли методику культуры тканей. Полученные ими результаты подтверждают устойчивость клеток к замораживанию при условии быстрого их оттаивания, а также благоприятное действие предварительной обработки глицерином или родственными ему веществами. И сейчас уже нет никаких сомнений в том, что с помощью указанных защитных агентов кожу животных и человека можно хранить продолжительное время при очень низких температурах в состоянии «приостановленной» жизни. После быстрого оттаивания многие клетки оживут, в них восстановится способность к росту и делению in vitro или in vivo. Более того, ткань в целом представляет собой живой трансплантат, способный полностью выполнять нормальную функцию кожи при ортотопической трансплантации той же особи, у которой она была взята несколько месяцев или даже год назад. Это может иметь большое значение с терапевтической точки зрения. Так, во время операции можно получить без вреда для больного кусочки кожи и сохранять их для дальнейшего использования, например при лечении тяжелых ожогов или ампутации конечностей, или же на всякий «непредвиденный» случай. С биологической точки зрения кожу можно использовать после хранения в течение различных периодов времени в условиях очень низких температур для получения «возрастных химер» (согласно терминологии Медавара), способствующих выяснению некоторых явлений, связанных со старением. Замороженную кожу, разумеется, можно применять для гомотрансплантации. Как и свежий гомотрансплантат, она фиксируется в первые дни после трансплантации и даже, возможно, будет расти в течение первых двух недель. Вместе с тем окончательному приживлению кожи будет препятствовать иммунологическая реакция реципиента на чужеродную ткань. Если эту реакцию не подавить или не изменить, то скорее всего последует отторжение трансплантата. Доказано, что хранение кожи при несколько неблагоприятной температуре (—60°) изменяет ее антигенные свойства, не влияя на выживаемость.

В течение всего периода времени до отторжения гомотрансплантаты кожи могут служить хорошим защитным покровом при ожогах или других травмах. Они предотвращают потерю жидкостей и преграждают путь инфекции, пока больной не оправится от первоначального шока. Еще большее значение приобрели бы банки для хранения кожи при низкой температуре, если бы такие средства, как 6-меркаптопурин либо какое-нибудь другое вещество или антиметаболит, подавляющие реакцию взрослого животного на растворимые антигены, снимали иммунологическую реакцию на кожные трансплантаты.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: