Факультет

Студентам

Посетителям

Замораживание кожи, роговицы и других тканей млекопитающих

Тейлор и Герстнер применяли культуру тканей для изучения выживаемости клеток кожи, замороженной различными способами.

Они сравнивали действие замораживания на кожу плода, новорожденных, а также неполовозрелых и взрослых мышей и крыс. Кожа незамороженного плода или новорожденного животного росла in vitro лучше, чем кожа взрослых крыс и мышей. За исключением этого отличия, возраст, по-видимому, не оказывал существенного влияния на выживаемость тканей после замораживания и оттаивания в различных условиях. Необработанная кожа, замороженная путем охлаждения до температуры жидкого азота в течение 30 сек и оттаянная приблизительно за 1 сек, не давала роста в 99% случаев. Лишь изредка наблюдалось размножение небольшого числа клеток. Все пробы, обработанные до быстрого замораживания и оттаивания 20— 30-процентным раствором этиленгликоля, при пересеве давали рост; в 13% случаев культуры ничем не отличались от контрольных, а в 80% результаты были вдвое хуже, чем в незамороженных пробах. Обработка 20— 30-процентным раствором глицерина снижала рост клеток в кусочках незамороженной кожи на 25%, а обработка 50-процентным раствором снижала рост почти наполовину. Когда кожу замораживали в растворе, содержащем более 50% глицерина, наблюдался такой же рост клеток, как и в кусочках незамороженной, но обработанной глицерином кожи. Все повреждения кожи можно было отнести за счет вредного действия глицерина, а не замораживания. Важно отметить, что перед культивированием кусочки кожи промывали в четырех порциях раствора Тироде, не содержащего глицерина. По-видимому, указанные повреждения наступали во время отмывания. Исследования под микроскопом показали наличие тяжелых повреждений клеток в необработанной коже после замораживания и оттаивания. Вместе с тем в коже, замороженной и оттаянной в присутствии этиленгликоля или глицерина, не наблюдалось видимых повреждений клеток. Они наступали при перенесении ткани в нормальную среду.

Помера и Мурхэд засняли на кинопленке действие глицерина на культуры эпидермальных клеток взрослого человека. В необработанных культурах в краевых клетках наблюдался выраженный пиноцитоз. Он прекращался при добавлении в среду 2% глицерина, но через несколько минут опять возобновлялся, так что культуры вскоре принимали нормальный вид. Когда концентрацию глицерина последовательно повышали до 4, 6, 8 и 10%, в краевых клетках повторялось прекращение и возобновление пиноцитоза. Клетки, инкубированные в течение 24 час в среде, содержащей 10% глицерина, а затем подвергшиеся воздействию 20-процентного его раствора, восстанавливались по мере постепенного удаления глицерина и через несколько часов культуры выглядели нормально, а большинство клеток проявляли полную активность, включая пиноцитоз.

Иногда кусочки кожи, не развивавшиеся in vitro, хорошо приживали при подсадке взрослым или неполовозрелым крысам и мышам, у которых они были взяты. Полученные результаты позволяют предполагать, что в некоторых случаях условия культуры ткани, возможно, оказываются слишком жесткими для проверки выживаемости кожи грызунов после замораживания.

Впоследствии Тейлор охлаждал полоски кожи плода, погружая их в жидкий пентан, охлажденный до — 190°. Температура снижалась со скоростью 100° менее чем за 10. сек. Тейлор проводил также медленное охлаждение со скоростью 100° за 7—60 мин и определял жизнеспособность препаратов в культурах тканей. Он нашел, что быстрое охлаждение имело существенное значение, но при наличии глицерина не наблюдалось большого различия в росте эксплантатов, замороженных и охлажденных с разными скоростями. Однако он не проверил действие медленного охлаждения со скоростью 1° в 1 мин от 0 до —15 или —20° с последующим более быстрым охлаждением до —79 или —190°. Между тем такая методика давала хорошие результаты в опытах на обработанных глицерином клетках и тканях многих типов, в том числе сперматозоидов, овариальной ткани, а также кожи и роговицы других млекопитающих.

Роговицу обрабатывали 15-процентным раствором глицерина, медленно охлаждали до —79°, хранили при этой температуре, а затем оттаивали и успешно подсаживали животным и человеку без проверки ее жизнеспособности с помощью культуры тканей. Позднее Эрл и сотрудники показали, что роговица кролика, пропитанная раствором, содержащим 15% глицерина, и медленно охлажденная до —79°, всегда даст энергичный рост эпителиальных и веретенообразных клеток. Какое-то незначительное замедление процесса наблюдалось перед началом миграции клеток, но вскоре культуры обработанной глицерином и замороженной роговицы нельзя было отличить от свежей ткани. В 28% случаев роговица, охлажденная без глицерина, не давала роста, а в остальных случаях наблюдались тяжелые повреждения и задержка роста клеток.

Можно было предполагать, что эпителиальные клетки внутренних органов более чувствительны к повреждениям во время замораживания, чем клетки многослойного плоского эпителия кожи и роговицы. Тем не менее Клинке в 1939 г. обнаружил живые клетки в кусочках почечной ткани 6-недельного кролика после замораживания их в жидком азоте. Ему иногда удавалось добиться роста типичного почечного эпителия после оттаивания и посева. Позднее появилось сообщение, что кусочки почек теленка хорошо переживали обработку глицерином, медленное охлаждение и хранение при —79°. При посеве клетки пролиферировали так же, как в контрольных незамороженных кусочках. Взвеси почечных клеток обезьяны, обработанных трипсином, консервировали путем медленного охлаждения в среде, содержащей 15% сыворотки и 5% глицерина. При этом 70% согретых и культивированных клеток оказались жизнеспособными и были использованы для культивирования вирусов.

Один из недостатков метода хранения живых клеток в культурах тканей заключается в их дедифференциации, а также в изменении внешнего вида и присущих им свойств. Особенно это наблюдается при длительном культивировании, когда в течение ряда лет требуется неоднократно осуществлять пересевы. Использование глицерина и медленного охлаждения сделало возможным замораживание культивированных клеток чистых штаммов, включая фибробласты мыши, кролика и человека, и сохранение их жизнеспособности в течение многих месяцев и лет в условиях консервации при низких температурах. Таким путем удалось сохранить различные клетки злокачественных опухолей, в том числе клетки HeLa и клетки мышиной лимфосаркомы. Гаушка и сотрудники организовали банк замороженных тканей, в котором на протяжении 1—2 лет хранили 82 типа тканей (опухолевых и здоровых) в среде, содержащей 10—15% глицерина, при температуре —78°. Некоторые типы клеток и тканей были чувствительны к быстрому замораживанию, но зато переживали медленное охлаждение со скоростью 1° в 1 мин в пределах от 0 до —25°. В законсервированных таким путем клетках не наблюдалось никаких изменений; тем самым авторам удалось избежать дополнительных затрат времени и средств на сохранение клеток с помощью пересева культур.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: