Факультет

Студентам

Посетителям

Жизнеспособность замороженной роговицы глаза млекопитающих

Еще в 1771 г. Квенгси высказал предположение о возможности замены рубцовоизмененной помутневшей роговицы хрустальной линзой соответствующей формы.

С тех пор неоднократно предпринимались попытки заменить роговицу искусственными линзами, и в последние годы для этой цели использовали различные пластмассы. Однако недостаток таких линз, который не удалось устранить до настоящего времени, заключается в том, что они выпадают или плохо действуют на зрение в результате образования позади них фиброзной ткани. Прошло 120 лет с той поры, как Киссам осуществил первую трансплантацию роговицы у человека. Для замены рубцовоизмененной роговицы он использовал роговицу поросенка. Непосредственно после операции зрение больного улучшилось, но позднее трансплантат помутнел и в конце концов превратился в рубцовую ткань. С тех пор в литературе время от времени появлялись сообщения об успешной гетеротрансплантации роговицы у человека и животных. В большинстве случаев, однако, гетеротрансплантация роговицы не удавалась. Вместе с тем накопился обширный клинический и экспериментальный материал, показывающий, что при ортотопической имплантации в переднюю камеру глаза гомологичная роговица дает удовлетворительные, никогда не мутнеющие трансплантаты. В конце XIX и в начале XX вв., когда фон Хиппель и Цирм проводили первые работы в этой области, нередко приходилось хирургическим путем удалять глаза с еще прозрачной роговицей. Таким образом, в распоряжении врачей всегда было необходимое количество роговицы для трансплантации. С годами, однако, положение изменилось в связи с применением консервативных методов лечения некоторых заболеваний. Кроме того, потребности в трансплантатах возросли благодаря увеличению числа хирургов, овладевших этим методом. В 1922 г. Филатов сообщил, что удовлетворительные результаты при гомотрансплантации давала роговица трупов, которую он предварительно хранил в холодильнике. Впоследствии было установлено, что роговицу можно брать у трупа на протяжении 15 час после смерти и с успехом имплантировать после хранения в течение 2—3 недель in vitro в стерильном жидком парафине при температуре +4°. Во время хранения жизнеспособность клеток, вероятно, постепенно снижается.

Успех ортотопической гомотрансплантации роговицы находился в явном противоречии с неудачами, на которые были обречены попытки ортотопической гомотрансплантации кожи человека и животных. Единственно возможное объяснение заключалось в том, что имплантированная роговица как бы создает почву для прорастания клеток реципиента и, следовательно, не обязательно должна быть живой. Вряд ли можно сомневаться в том, что эпителий, покрывающий переднюю поверхность трансплантата, постепенно заменяется гомологичными клетками реципиента. Известны случаи удовлетворительного приживления роговицы, лишенной эпителиального слоя. В то же время существуют предположения, что для удовлетворительного приживления трансплантатов клетки собственно ткани роговицы должны быть живыми. Так, почти все исследователи находят, что роговица, предварительно фиксированная в формалине, спирте или других химических соединениях, убивающих клетки, а также роговица, облученная летальными дозами рентгеновских лучей, вскоре подвергается фиброзному перерождению и утрачивает прозрачность, даже если она как будто бы прижила и в нее проросли клетки реципиента. Смельсер и Озэйникс обнаружили также, что роговица, замороженная при температуре жидкого азота, приживала после гомотрансплантации, но сохраняла прозрачность в течение не более 4 дней. Затем она становилась как бы подернутой дымкой и отечной, и в нее постепенно прорастали кровеносные сосуды из склеры реципиента. К концу второй недели после имплантации роговица была совершенно мутной и к концу 4-й или 5-й недели оставалась мутной и плохо снабжалась кровью. Спустя различные периоды времени после операции — от 6 недель и до 2 месяцев — приживленные трансплантаты или становились совершенно мутными, или еще просвечивали, но никогда не были прозрачными.

Смельсер и Озэйникс замораживали весь глаз кролика. В 8 опытах глаза вначале погружали в изопентан, охлажденный жидким азотом, а затем переносили в жидкий азот, из которого извлекали спустя различные сроки — от 2 час до 3—4 дней. После этого глаза оставляли для оттаивания при комнатной температуре и, когда роговица уже достаточно оттаяла, а водянистая влага и остальная часть глаза были еще в замороженном состоянии, иссекали трансплантат. В настоящее время известно, что такое медленное оттаивание гибельно для многих клеток, в том числе и для клеток кожи, которые могут пережить замораживание и быстрое оттаивание. Не доказано, что роговица, замороженная, хранившаяся при очень низкой температуре и затем согретая без участия каких-либо защитных агентов, даст устойчивые прозрачные трансплантаты. Вейес и Тейлор сообщили об удовлетворительных результатах гомотрансплантации лиофилизированной роговицы. Роговицу крысы замораживали в изопентане при —150°, затем в течение нескольких дней из нее при —40° удаляли влагу и после этого ее хранили в запаянных пробирках. После оводнения роговица приобретала нормальную консистенцию и имела обычный вид. При гомотрансплантации такая роговица давала удовлетворительные трансплантаты. В трансплантат роговицы прорастали клетки реципиента, но она оставалась прозрачной. Позднее многие авторы изучали судьбу трансплантатов лиофилизированной роговицы у кроликов, морских свинок и других животных и обнаружили, что, несмотря на успешное приживление, все трансплантаты впоследствии стали мутными.

Недавно, однако, Энаф сообщил о целом ряде замечательных опытов, в которых гомо — и гетеротрансплантация лиофилизированной роговицы дала прекрасные функциональные результаты. Энаф в сотрудничестве с Рэ усовершенствовал методику лиофилизации. Большое значение в ней играла скорость замораживания ткани до возгонки льда в высоком вакууме. Наилучшие результаты получали при быстром замораживании ткани в жидком пропане при —196°. Лиофилизацию осуществляли в специальном аппарате, который допускал возгонку льда при температуре около —50°. Весь процесс лиофилизации занимал 12 час при использовании диффузионного насоса, создающего вакуум 10-3 мм рт. ст. Затем ткань увлажняли, добавляя физиологический раствор при комнатной температуре. Гистологическое строение роговицы полностью сохранялось. В то же время входящие в ее состав белки изменялись ввиду хорошего приживления как гетеро-, так и гомотрансплантатов. Роговица кролика, например, приживала в глазах собак, и наоборот. Имели место также случаи удачной гетеротрансплантации лиофилизированной роговицы у людей.

Насколько нам известно, результаты Энафа еще никем не повторены. Вероятно, эго объясняется тем, что консервация роговицы с помощью лиофилизации требует сложной дорогостоящей аппаратуры и квалифицированного обслуживающего персонала. Метод охлаждения до низких температур в присутствии глицерина значительно проще. Первыми стали хранить обработанную глицерином роговицу при очень низких температурах Роб и Исткот. Они воздействовали на роговицу животных и человека физиологическим раствором, содержащим 15% глицерина, и охлаждали ее до —79° по методике, применявшейся для ткани яичника. Роговицу хранили при этой температуре до самой трансплантации, когда ее быстро согревали при +40°. Предварительные результаты были обнадеживающими; трансплантаты в виде тонких пластинок, обработанные таким путем, приживали и оставались прозрачными в течение 6 недель. Другие результаты гомотрансплантации замороженной роговицы человека опубликовали Исткот и др. Материал для трансплантации брали у трупов как можно скорее после смерти, максимум через 12 час. В некоторых случаях консервировали роговицу во всю толщу ткани, а в других снимали пластинки различной толщины, с тем чтобы иметь в своем распоряжении трансплантаты требуемой толщины. Трансплантаты того и другого вида помещали в стерильные бутыли с завинчивающимися пробками и заливали раствором Рингера, содержащим 15% глицерина при pH 6. После выдерживания их в течение 1 час в комнатной температуре бутыли погружали в охлаждающую смесь, состоящую из спирта и углекислоты с температурой —79°, а затем хранили в твердой углекислоте различное время от 3 дней до 9 месяцев. За это время pH среды, по-видимому, значительно снижался в связи с растворением СO2. Роговицу оттаивали как можно быстрее, погружая бутыли в водяную баню с температурой +40°. Замороженные трансплантаты имплантировали таким же способом, как и свежий материал. Все трансплантаты в виде тонких пластинок прижили и вели себя во всех отношениях как свежая ткань. В течение всего периода клинического наблюдения, который в ряде случаев длился 10 месяцев, они оставались прозрачными. В двух случаях трансплантации (во всю толщу) замороженной роговицы также были получены успешные во всех отношениях результаты. В трех случаях такая трансплантация имела лишь частичный успех — трансплантаты сохранили прозрачность только в центральной части. Остальные два трансплантата полностью помутнели, и пришлось заново осуществить трансплантацию на этот раз свежей роговицы.

Успешные результаты, полученные при имплантации трансплантатов в виде тонких пластинок, позволяют предполагать, что клетки эпителия роговицы, а также собственно ткани роговицы переживали охлаждение до —79°. Биллингэм проверял жизнеспособность эпителиальных клеток, пересаживая обработанные глицерином замороженные тонкие трансплантаты роговицы кролика в специально подготовленный на груди участок, с которого была удалена кожа. На границах, отделяющих окружающую кожу от гетеротрансплантатов замороженной роговицы, хранившейся 1 месяц при —79°, появились пояски типичного для роговицы прозрачного эпителия. После этого уже не оставалось никаких сомнений в том, что большое число эпителиальных клеток переживало замораживание при —79°, хранение при этой температуре и последующее оттаивание. Показано, что клетки собственно ткани роговицы также переживают замораживание при —79°. Роговицу морских свинок обрабатывали раствором Рингера, содержащим 15% глицерина, охлаждали до —79° и хранили при этой температуре в течение 30 дней. После оттаивания ее имплантировали под кожу морским свинкам. Приблизительно через 20 дней реципиентам ввели радиоактивный сульфат (—S35O4), а еще через 16 час трансплантаты извлекли и подвергли гистологическому исследованию. Радиоавтограммы показали одинаковое поглощение S35 собственно тканью роговицы как в свежих, так и в замороженных трансплантатах. Следовательно, клетки, по-видимому, переживали замораживание и в них происходили нормальные метаболические процессы.

Полные и частичные неудачи при трансплантации во всю толщу роговицы свидетельствовали о возможном повреждении во время замораживания и оттаивания хрупких клеток эндотелия на задней поверхности роговицы. После трансплантации поврежденный эндотелий замещался фиброзной тканью, что в некоторых случаях приводило к помутнению трансплантатов во всю толщу свежей роговицы. В то же время повреждение эндотелия на задней поверхности роговицы должно вызвать нарушение нормального обмена между водянистой влагой и роговицей. Ридж показал, что потребление кислорода клетками эндотелия в роговице кролика снижалось, если физиологический раствор с pH 5,85 содержал хотя бы 1 % глицерина. При pH 8,8 эндотелий был резистентным к подавляющему влиянию глицерина в концентрациях, достигающих 10%. При pH 8,8 обработанный глицерином эндотелий оказывался почти полностью защищенным от губительного действия замораживания при —79° и последующего оттаивания. Об этом можно было судить по его потреблению О2, которое составляло 75% потребления кислорода свежей тканью. Таким образом, степень выживаемости замороженных трансплантатов во всю толщу роговицы человека и кролика, по-видимому, можно повысить, приведя pH в должное соответствие со средой и понизив концентрацию глицерина примерно до 10%.

Биллингэм и Райкрофт разработали свою методику замораживания и храпения роговицы. Для того чтобы пропитать роговицу глицерином, они при комнатной температуре погружают весь глаз на 1 час в раствор Рингера, содержащий 15% глицерина. Затем они удаляют жидкость и помещают глаз роговицей вверх в стеклянный сосуд с широким горлышком и с завинчивающейся крышкой или с притертой пробкой, смазанной силиконом. Для охлаждения сосуд окружают твердой СO2 с температурой —79°. Для последующего оттаивания глаз быстро отогревают, обильно поливая его теплым физиологическим раствором с температурой 38°. Замороженная роговица приобретает серый оттенок; она как бы испещрена пятнами и тверда на ощупь. В процессе оттаивания она быстро становится прозрачной, и в передней камере глаза появляются пузырьки воздуха. Когда температура роговицы достигает уровня нормальной температуры тела, маленькие пузырьки воздуха часто появляются и в ее строме. Прозрачность роговицы обусловлена особым расположением коллагеновых волокон, окруженных в строме основным веществом, содержащим мукоид. Возможно, оптические свойства роговицы претерпевают изменения в результате образования пузырьков или поглощения жидкости. Ридж полагает, что некоторые из этих пузырьков возникают вследствие метаболической активности ресничного тела в интактном глазе после смерти и что перед замораживанием, может быть, следует заменять водянистую влагу забуференной жидкостью. Однако, несмотря на возникновение этих пузырьков, Райкрофт использовал трансплантаты во всю толщу роговицы глаз, обработанных глицерином и хранившихся при —79° в течение многих месяцев. При этом он в ряде случаев получил хорошо функционирующие и немутнеющие трансплантаты. В других случаях консервированные трансплантаты имели оптические дефекты, обусловленные образованием складок и сокращением десцеметовой оболочки или отслойкой роговичных пластинок. Остается выяснить, что же служит причиной повреждения зрения — гибель части клеток или нарушение расположения коллагеновых волокон.

Одна из главных, еще не разрешенных проблем, связанных с хранением ткани при низких температурах, заключается в получении роговицы или глаза человека вскоре после смерти, до наступления посмертных изменений. Следует, однако, отметить, что задача продолжительного хранения роговицы частично уже разрешена.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: