Факультет

Студентам

Посетителям

Получение L-глютаминовой кислоты

Наиболее распространенными промышленными продуцентами глютаминовой кислоты в зарубежных странах являются мутантные штаммы культур Micrococcus glutamicus и некоторые представители рода Brevibacterium.

Предполагается, что биосинтез осуществляется за счет реакции восстановительного аминирования. Согласно этой реакции на первом ее этапе происходит неэнзиматическое соединение α-кетоглютаровой кислоты с аммиаком, в результате которой образуется иминоглютаровая кислота. На втором этапе иминоглютаровая кислота восстанавливается до глютаминовой кислоты под действием глютаматдегидрогеназы. Этот фермент имеет в качестве простетической группы (кофермента) никотинамид-адениндинуклеотид (НАД) или никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат (НАДФ).

Механизм реакции, как указывают В. Л. Кретович и В. И. Яковлева (1960), является гипотетическим и имеет только незначительные косвенные экспериментальные доказательства.

Наиболее активно восстановительное аминирование α-кетоглютаровой кислоты аммиаком протекает при pH 7,6. Восстановительное аминирование α-кетоглютаровой кислоты требует наличия сопряженных окислительно-восстановительных реакций. Поэтому в сфере реакции должны присутствовать химические вещества, способные восстанавливать окисленный коэнзим. К таким веществам относятся многие продукты цикла трикарбоновых кислот. Поскольку при ферментации они накапливаются в достаточном количестве, обычно не возникает необходимости вводить их специально в среды.

Из органических кислот, входящих в цикл трикарбоновых кислот, большое значение имеет лимонная кислота. Последняя под действием аконитатгидратазы превращается в изолимонную кислоту. За счет активности изоцитратдегидрогеназы происходит образование α-кетоглютаровой кислоты.

Механизм восстановительного аминирования доказан не для всех микроорганизмов, которые аккумулируют в среде глютаминовую кислоту. Например, синтез аминокислот у некоторых актиномицетов осуществляется путем первоначального аминирования пировиноградной кислоты с образованием аланина и последующей реакцией переаминирования с α-кетоглютаровой кислотой.

Одним из условий, обеспечивающих синтез глютаминовой кислоты, является наличие в среде α-кетоглютаровой кислоты. Если биосинтез осуществляется специальным ферментным препаратом, а не путем ферментации, то в качестве ингредиента реакции обычно вводят α-кетоглютаровую кислоту. Введение α-кетоглютаровой кислоты в питательную среду нерационально, так как она является дорогостоящим продуктом. Кроме того, она подвергается быстрой трансформации и поэтому в период, соответствующий интенсивному накоплению глютаминовой кислоты, она практически уже отсутствует в среде. Поэтому необходимо иметь условия, которые обеспечивали бы высокий уровень содержания а-кетоглютаровой кислоты в среде и дальнейшее ее преобразование в глютаминовую кислоту. Предполагают, что α-кетоглютаровая кислота поступает в клетки, где происходит реакция переаминирования со свободными внутриклеточными аминокислотами. Избыток синтезированной глютаминовой кислоты поступает в среду. Поэтому высокий уровень α-кетоглютаровой кислоты и надлежащая величина pH являются одними из основных условий, обеспечивающих интенсивный биосинтез.

В качестве источника углерода обычно вводят глюкозу, сахарозу, иногда крахмал, а в странах Востока считают весьма эффективным применение крахмала, полученного из тапиоки. Из источников азота — соли аммония и мочевину. В качестве «затравки» бывает полезно добавлять α-кетоглютаровую кислоту в незначительном количестве.

Диссимиляция глюкозы Micrococcus glutamicus и Brevibacterium flavum может происходить путем анаэробного гликолиза и по гексозо-монофосфатному шунту. Последний наблюдается при хорошей аэрации культуральной жидкости. Он является предпочтительным для биосинтеза глютаминовой кислоты. В случае, если преобладающим путем диссимиляции глюкозы будет анаэробный гликолиз, то в среде вместо глютаминовой кислоты преимущественно накапливается молочная кислота.

Для некоторых культур, продуцентов аминокислот, показано, что промежуточный обмен углеводов может осуществляться не только посредством цикла дикарбоновых и трикарбоновых кислот, но также посредством разновидности этого цикла, в которой участвует глиоксиловая кислота. Особенностью этого цикла являются реакции, в результате которых изолимонная кислота превращается в глиоксиловую, а затем в яблочную кислоту (при участии малатсинтетазы глиоксиловая кислота конденсируется с ацетил-КоА.

Концентрация углеводов в средах при получении аминокислот обычно довольно высокая, до 5—10%. Соотношение N:C в исходных средах здесь значительно выше по сравнению со средами для биосинтеза антибиотиков. Например, для культуры Micrococcus glutamicus оптимальными концентрациями мочевины при 3, 5, 7 и 10% глюкозы соответственно будут 0,5; 0,8; 1,1; 1,5%.

В связи с этим среда довольно быстро окисляется. Для предотвращения закисления и повышения содержания азота в культуральную жидкость Micrococcus glutamicus периодически вводят стерильный раствор мочевины, чтобы после его добавления величина pH была около 7,0. Под действием уреазы мочевина распадается, а образующийся ион аммония вступает в реакцию с α-кетоглютаровой кислотой. Для некоторых культур введение значительных количеств мочевины может оказать токсическое влияние, поэтому рекомендуется вводить нитраты.

Помимо перечисленных компонентов, в среды вводят фосфаты, соли магния, железа, марганца. Особенно важно наличие в среде цинка, так как присоединение НАД или НАДФ к молекуле белка фермента осуществляется через атомы цинка.

Процесс биосинтеза глютаминовой кислоты имеет двухфазный характер. Накопление глютаминовой кислоты происходит тогда, когда рост культуры практически закончен. Весь процесс продолжается около двух суток в ферментерах, в аэробных условиях. Некоторые мутанты, продуцирующие глютаминовую кислоту, требуют наличия в среде определенных концентраций биотина. Биотин оказывает существенное влияние на метаболизм глюкозы и, в частности, на формирование из пировиноградной кислоты лимонной кислоты, из которой образуется α-кетоглютаровая кислота:

Избыток биотина ведет обычно к накоплению молочной кислоты и продуктов ее последующего окисления. Биотин стимулирует гликолиз. При избытке биотина происходит интенсивное потребление глютаминовой кислоты. При низких концентрациях биотина идет образование α-кетоглютаровой кислоты, а при наличии в среде ионов аммония — синтез глютаминовой кислоты.

По мнению К. Танака, С. Акита, К. Кимура и С. Киносита (1960), основными факторами, определяющими соотношение продуктов обмена в культуре Micrococcus glutamicus, являются концентрация в среде биотина, парциальное давление кислорода и содержание иона аммония.

Положительный эффект на образование глютаминовой кислоты Micrococcus glutamicus оказывает совместное присутствие в среде биотина и поверхностно активных веществ. Более значительный эффект достигается при введении последних на ранней стадии культивирования.

Имеются данные о том, что повышение выхода аминокислот при их биосинтезе может быть достигнуто путем введения в среду ингибиторов ферментативных реакций, ответственных за трансформацию кетокислот, в частности фтористого натрия.

При использовании в качестве продуцента грибов рода Cephalosporium удается сократить время ферментации до 12 ч. Процесс может идти в анаэробных и аэробных условиях, при pH 4,0—8,0.

Выделение глютаминовой кислоты и ее очистка достигаются относительно несложными технологическими операциями: осаждение при кислом pH, сорбция и элюция на ионообменных смолах и кристаллизация в виде моноглютамата натрия.

Продуценты глютаминовой кислоты Micrococcus glutamicus и Micrococcus flavum при определенных условиях культивирования могут синтезировать в качестве основного продукта ферментации глютамин. Главными факторами, определяющими направление процесса ферментации, являются концентрация ионов аммония, pH культуральной жидкости и содержание биотина. При использовании в качестве одного из компонентов среды кислых солей аммония в концентрациях, превышающих их содержание при ферментации глютаминовой кислоты, отмечается сдвиг pH в кислую зону до 5,5. При этих условиях биосинтез глютаминовой кислоты угнетен.

Наиболее удачные ферментации позволяют получить до 20% глютамина в расчете на исходное содержание глюкозы в среде для культивирования. Поскольку параллельно с глютамином в культуральной жидкости содержится глютаминовая кислота, последнюю посредством фермента из Pseudomonas crusiviae переводят в пирролидон-карбоновую кислоту. Глютамин в отличие от последней сорбируется на катионите, затем его элюируют раствором аммиака, элюат концентрируют, а глютамин выпадает в осадок после добавления к концентрату этанола.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: