Факультет

Студентам

Посетителям

Биосинтез 6-аминопенициллановой кислоты

6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) представляет собой ядро пенициллина — центральную часть молекулы пенициллина без бокового радикала.

Впервые 6-АПК была получена синтетическим путем. Позже она была обнаружена среди продуктов метаболизма многих пенициллинообразующих штаммов. Она обладает весьма низкой антибактериальной активностью. Большое внимание, которое привлекла в последнее время 6-АПК, объясняется тем, что она легко ацилируется хлорангидридами различных кислот с образованием соответствующих пенициллинов.

В связи с этим представляется возможность получать из 6-АПК простым химическим методом практически неограниченное количество пенициллинов с различными новыми радикалами.

Из пенициллинов, синтезированных на основе 6-АПК, наибольший интерес для медицинской практики представляют броксил [натриевая соль 6 (α-феноксипропионил)-амино-пенициллановой кислоты]; селбенин [натриевая соль 6-(2’6′-диметоксибензоил)-аминопенициллановой кислоты]; пенбритин [6(α-аминофенилацетил)-аминопенициллановая кислота]. Полученные новые пенициллины обладают весьма ценными качествами: броксил-пенициллин — стабильностью в кислой среде и хорошей всасываемостью; селбенин — устойчивостью к пенициллиназе (ферменту, разрушающему β-лактамное кольцо) и, следовательно, активностью против устойчивых форм стафилококков; пенбритин — стабильностью в кислой среде и широким антибактериальным спектром. Антибактериальный спектр пенбритина гораздо более широкий, чем у всех известных пенициллинов. Пенбритин бактерициден не только против грамположительных кокков, но и против грамотрицательных бактерий.

Приведенные выше наименования препаратов являются торговыми названиями. Международные непатентные наименования их следующие: фенетициллин (броксил); ампициллин (пенбритин); метициллин (селбенин).

Получение 6-АПК при ферментации без предшественника. При изучении продуктов биосинтеза в культуральной жидкости Pen. chrysogenum было обнаружено вещество, не дающее специфическую реакцию на пенициллины. Позже было установлено, что, наряду с пенициллинами, имеющими радикалы, происходит синтез лишенной радикалов 6-АПК — пенициллинового ядра. Образуется 6-АПК в культуральной жидкости при ферментации без предшественников. В зависимости от штамма соотношения между типами пенициллинов и 6-АПК оказываются различными. Так, штамм Pen. chrysogenum № 136 при ферментации на синтетической среде образовывал биологически активные пенициллины в количестве, в 5 раз превышающем количество 6-АПК. Обратная картина наблюдалась для штамма № 194, он синтезировал 6-АПК в 3 раза больше, чем пенициллинов.

Образование 6-АПК в большой степени зависит от состава среды. Соотношения различных пенициллиноподобных веществ при ферментации на разных средах отличаются весьма значительно. Можно было ожидать, что для биосинтеза 6-АПК наиболее благоприятной окажется синтетическая среда, поскольку комплексные среды содержат или образуют в процессе ферментации вещества, которые могут использоваться грибом в качестве предшественников. Однако на некоторых комплексных средах, в частности на средах с кукурузным экстрактом, процент 6-АПК по отношению к общему количеству пенициллиноподобных веществ, образующихся при ферментации, выше, чем на синтетической среде. Биохимические изменения культуральной жидкости при ферментации без предшественника практически не отличаются от таковых при биосинтезе пенициллина: углеводы хорошо потребляются грибом, pH постепенно поднимается, и в период интенсивного биосинтеза 6-АПК держится обычно на уровне 7,0—7,4. Максимум накопления 6-АПК в ферментерах достигает к 108—120 ч.

Частичная замена в средах углеводов жирами приводит к снижению количества синтезированной 6-АПК и одновременно к увеличению биологически активных пенициллинов.

Получение 6-АПК путем ферментации без предшественника и ее последующее выделение в виде кристаллического продукта из нативного раствора, вследствие высокой гидрофильности продукта, признано многими исследователями дорогим и нерентабельным способом.

Получение 6-АПК ферментативным гидролизом. 6-АПК может быть получена ферментативным гидролизом бензилпенициллина посредством пенициллинамидазы, отщепляющей фенилуксусную кислоту.

Поскольку пенициллинамидаза осуществляет также обратную реакцию, т. е. ацилирование 6-АПК, ее называют иначе пенициллинацилазой. Наличие ацилазы установлено у многих микроорганизмов.

Найдено по крайней мере два типа ацилазных ферментов. Один тип фермента широко распространен среди актиномицетов, некоторых дрожжей и грибов. Этот тип быстро расщепляет так называемые «природные» пенициллины (К, F, дигидро-F), а также феноксиметилпенициллин и лишь очень медленно гидролизует бензилпенициллин (приблизительно в 100 раз медленнее). Данный тип относится к внеклеточным ферментам. Отделенные от культуральной жидкости клетки не обладают ацилазной активностью.

Второй тип ацилазных ферментов был обнаружен преимущественно у бактерий. Это тип фермента быстро расщепляет бензилпенициллин и значительно медленнее феноксиметилпенициллин. Он относится к внутриклеточным ферментам, и практически вся ферментная активность связана с клетками.

Внеклеточная и внутриклеточная ацилазы имеют различные оптимальные значения pH. Для внеклеточной ацилазы оптимум pH равен 9,0, для внутриклеточной — 7,3—8,5. Оптимальные температуры соответственно 50 и 40° С.

Для ферментативного расщепления бензилпенициллина наиболее часто используют культуру Escherichia coli. Чтобы получить клетки, обладающие высокой энзиматической активностью, необходимо соблюдать определенные условия культивирования, которые в равной мере относятся как к Е. coli, так и к другим продуцентам. Эти условия заключаются в следующем: наличие в среде для культивирования минеральных солей, белков, аминокислот, например гидролизата казеина, являющегося основным источником углерода и азота, или кукурузного экстракта; незначительное содержание углеводов; поддержание в культуре интервала pH равного 6,5—8,5, особенно к концу культивирования. Температура должна быть в пределах 20—40° С; культура должна хорошо перемешиваться.

Весьма существенное влияние на биосинтез энзима оказывает фенилуксусная кислота, которая входит в состав среды для культивирования. В присутствии фенилуксусной кислоты энзиматическая активность клеток возрастает в 3—10 раз. Фенилуксусная кислота является индуктором биосинтеза фермента. Ни одно из изученных производных фенилуксусной кислоты или веществ, структурно близких к ней, не обладает столь высоким индуцирующим действием. Положительное влияние на биосинтез фермента оказывает добавление в среду витаминов и факторов роста в виде дрожжевого экстракта, а из аминокислот — глютаминовой кислоты. Резко стимулирует процесс биосинтеза цинк. Полагают, что он входит в состав молекулы фермента.

Пенициллинамидазу, помимо Е. coli, образует ряд других культур, в частности Bact. faecalis alcaligenes. Условия, оптимальные для синтеза фермента, у нее несколько иные, чем у Е. coli. Синтез фермента тормозят некоторые органические кислоты, в частности молочная и уксусная. Стимулирующее действие оказывают триптофан и ряд других индольных производных: β-3-индолилпропионовая, 3-индолилуксусная, 3-индолилмолочная, β-3-индолилакриловая кислоты. Очевидно, β-3-индолилпропионовая кислота превращается в антраниловую кислоту, а последняя — в триптофан. Отсутствие триптофана в белках, которые входят в состав питательных сред для получения пенициллинамидазы, приводит к росту малоактивной культуры (В. А. Готовцева, М. М. Левитов, 1965).

Помимо ацилазы, некоторые микроорганизмы образуют пенициллиназу, за счет чего происходит частичное разрушение находящегося в сфере реакции бензилпенициллина. При подборе среды необходимо учитывать активность обоих ферментов, стараясь получить возможно большую активность ацилазы и возможно меньшую пенициллиназы. Описаны мутанты, у которых синтез пенициллиназы практически не происходит.

Для энзиматического гидролиза бензилпенициллина существенное значение имеет количественное содержание антибиотика и бактериальных клеток в сфере реакции. Как правило, наилучшие результаты, с точки зрения количественного выхода 6-АПК, достигаются при относительно невысоком содержании антибиотика, не выше 3%. При высоких концентрациях пенициллина, даже при значительной массе клеток, процесс гидролиза, протекающий вначале с большой скоростью, постепенно замедляется, несмотря на наличие в среде значительных количеств неразложенного субстрата.

При ацилазном расщеплении молекулы бензилпенициллина в среде накапливается в значительном количестве два специфических продукта — 6-АПК и фенилуксусная кислота, присутствие которых может влиять на проявление ацилазной активности клеток. Изучение действия этих продуктов показало, что 6-АПК на ацилазную активность клеток не влияет и под действием бактериальных ферментов дальше не разрушается. Фенилуксусная кислота постепенно исчезает из инкубационного раствора, окисляясь микробными клетками. Таким образом, на торможение ацилазной активности оказывают влияние какие-то не изученные пока продукты обмена.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: