Для электронной микроскопии обычно требуются лиофилизированные образцы материала, замороженного при температуре от —30 до —60°.
Высушенные образцы заключают, а затем приготовляют срезы. Полученные препараты, как полагают, сохраняют полностью вид ткани, который она имела в замороженном состоянии, и на них можно различить пустые пространства, показывающие места расположения кристаллов льда. С помощью электронной микроскопии были получены поразительные результаты. Меримэн и Платт, например, обнаружили, что при быстром замораживании печени кролика, когда фронт кристаллизации распространялся со скоростью более 6 мм/мин, микроскопические кристаллики льда равномерно распределялись внутри и вне клеток, как показывало расположение отверстий в приготовленных препаратах. При скорости распространения фронта кристаллизации 1,6 мм/мин кристаллы были крупнее и располагались вне клеток, Размеры внеклеточных кристаллов и сморщивание клеток были еще большими, когда скорость распространения фронта кристаллизации понизилась до 0,5 мм/мин. Подобные результаты были получены и при замораживании волокон поперечно-полосатой мышцы кролика. Примечательно, что образцы замороженной и согретой ткани печени и мышцы с гистологической точки зрения почти не отличались от незамороженных контрольных тканей.
Внешний вид препаратов медленно замороженных тканей заставляет предполагать, что центры кристаллизации образовывались во внеклеточном пространстве и что по мере их роста они удаляли воду как из этого пространства, так и из самих клеток до тех пор, пока вся присутствующая вода не превращалась в лед. Чем медленнее протекало охлаждение, тем крупнее были кристаллы льда. При быстром охлаждении печени кристаллы, очевидно, образовывались и росли одновременно как внутри, так и вне клеток.
Меримэн пришел к выводу, что, если скорость замораживания не очень высока, кристаллы льда образуются только вне отдельных клеток независимо от того, замораживают ли эти клетки в виде ткани или в виде взвеси. По мере роста кристаллов внеклеточное осмотическое давление повышается, в результате чего вода выходит из клеток и вымерзает во внеклеточном пространстве. Следовательно, клетки обезвоживаются и кристаллы льда образуют инертные инородные тела между ними. Исследования, проведенные на собаках, показали, что нога может выжить после того, как в глубоко лежащих тканях температура была в течение 15—30 мин ниже точки замерзания. Несомненно, при этом происходила кристаллизация льда, но, как предполагает Меримэн, кристаллы образовывались вне клеток и не причиняли им механического повреждения. Следует, однако, помнить, что при медленном охлаждении, как показали наблюдения непосредственно под микроскопом, кристаллы образовывались не только вне, но и внутри клеток.
В настоящее время уже имеются некоторые данные относительно действия сверхбыстрого охлаждения. Меримэн сообщает, что рентгенографические исследования показали наличие мельчайших кристаллов в препаратах эритроцитов после сверхбыстрого охлаждения их до очень низких температур. Сейчас еще нет достаточно убедительных доказательств того, что цитоплазма живых клеток может перейти в стекловидное состояние и совершенно не содержать кристаллов льда.
Вейсс и Армстронг изучали с помощью электронного микроскопа цитологические изменения в клетках, согретых после замораживания при —79°. Они использовали для этого взвеси клеток асцитной мышиной саркомы 37 и клеток HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины). Суспензионной средой служил уравновешенный солевой раствор Хэнка, содержащий человеческую сыворотку. В некоторых опытах в раствор добавляли 15% глицерина. Пробы медленно охлаждали до —79° по методике, принятой для охлаждения бычьих сперматозоидов и ткани яичника. Затем их быстро отогревали, фиксировали при комнатной температуре и делали срезы. Замороженные и оттаянные клетки наблюдали под фазовоконтрастным, а также под электронным микроскопом и сравнивали с образцами, приготовленными при комнатной температуре. В цитологической характеристике клеток, замороженных без глицерина, отмечались резкие отклонения от нормы. В частности, отделялись друг от друга два слоя ядерной оболочки и между ними образовывались большие пузыри, по-видимому, в результате локализованного расширения оболочки. Хроматин ядра склеивался в бесформенные комочки, и некоторые наиболее поврежденные ядра имели характерный бледный вид. При предварительной обработке глицерином все эти явления не наступали. Плотные ядрышки не повреждались. В цитоплазме также имелись пузыри, причем некоторые из них образовывались внутри двойной мембраны, окружающей митохондрии, как показывают разорванные, но опознаваемые остатки крист. Другие пузыри, по-видимому, были связаны с эндоплазматической сетью. Доля поврежденных клеток была меньшей, а цитологические изменения выражены не так сильно в образцах, замороженных и оттаянных в присутствии глицерина, хотя глицерин иногда вызывал набухание митохондрий в незамороженных клетках. Клетки HeLa не переживали замораживания без глицерина, но при обработке глицерином большое число их, судя по размножению в культуре тканей, сохраняло жизнеспособность после замораживания. Клетки саркомы переживали замораживание при —79° в неразбавленной асцитической жидкости или в среде, содержащей глицерин. Когда же их замораживали и оттаивали в уравновешенном солевом растворе, содержащем человеческую сыворотку, но без примеси глицерина, они погибали. Введение, этих клеток мышам не вызывало у них образования опухоли.
При помощи электронной микроскопии изучали также клетки щитовидной железы и яичника после охлаждения их до —79° в различных средах и последующего оттаивания. Полученные результаты показали, что внутриклеточные мембраны нормальных клеток, в частности эндоплазматическая сеть, получают тяжелые повреждения при замораживании и оттаивании в отсутствие глицерина. Эти результаты особенно интересны и важны, поскольку наблюдавшиеся между двойными мембранами пространства нельзя было приписать образованию ледяных кристаллов, так как материал подвергали оттаиванию до фиксации. Очевидно, внутриклеточные мембраны повреждаются не кристаллами льда в процессе замораживания и оттаивания, а в результате каких-то других изменений. Известно, что различные внутри — и внеклеточные мембраны содержат много липопротеида. Лавлок показал, что в связи с повышением концентрации солей или изменениями pH при вымерзании воды молекулы липопротеида особенно чувствительны к повреждениям во время замораживания и оттаивания. Исследования Вейсса и Армстронга подкрепляют тот взгляд, что кристаллы льда не обязательно являются причиной повреждения живых клеток во время охлаждения до низких температур и последующего оттаивания.
Данные микроскопических наблюдений можно суммировать следующим образом.
1. При медленном охлаждении до низких температур живых клеток, взвешенных в обычной физиологической среде, наблюдается тенденция к переохлаждению материала. В точке замерзания или после предшествующего переохлаждения может наступить кристаллизация льда. Кристаллы льда в первую очередь образуются в среде или в тканевых жидкостях, омывающих клетки. По мере понижения температуры некоторые виды клеток постепенно обезвоживаются, так как молекулы воды выходят из клеток во внешнюю среду и там превращаются в лед. Чем медленнее охлаждение, тем больше размер кристаллов. Другие клетки вначале частично обезвоживаются, но затем в них наступает процесс внутриклеточной кристаллизации. Кристаллы льда могут образоваться как в ядре, так и в цитоплазме. Может происходить также миграционная перекристаллизация, в результате которой как внутри, так и вне клеток мелкие кристаллы превращаются в крупные. Особенно часто подобная перекристаллизация наблюдается во время медленного оттаивания и при температуре выше —40°. После оттаивания иногда наблюдается полный распад клеток или же клетки полностью восстанавливают свой нормальный гистологический вид независимо от того, происходила ли внутриклеточная кристаллизация. Клетки млекопитающих, медленно охлажденные до —79° в отсутствие глицерина, редко сохраняют жизнеспособность. Если даже гистологически они выглядят нормальными, под электронным микроскопом обнаруживаются глубокие цитологические изменения. Различные мембраны (цитоплазмы и ядра) получают тяжелые повреждения в результате каких-то других процессов, а не образования кристаллов льда.
2. Во время быстрого охлаждения живых клеток и тканей до низких температур кристаллизация может происходить одновременно внутри самих клеток и в окружающей их среде или в тканевой жидкости. Чем быстрее проводят охлаждение, тем меньше размер первоначально образовавшихся кристаллов. Впоследствии в результате процесса миграционной перекристаллизации размер кристаллов может увеличиться. Этот процесс оказывает разрушающее действие. Согласно общему мнению, клетки не переживают внутриклеточной кристаллизации. В настоящее время правильность этого положения вызывает некоторые сомнения. Известен один тип клеток насекомых, переживающих образование внутриклеточных кристаллов как в естественных, так и в экспериментальных условиях. Потребуется много исследований для выяснения совместимости внутриклеточной кристаллизации с выживанием клеток после быстрого или медленного охлаждения. Имеются данные, позволяющие предполагать, что в препаратах живых клеток после сверхбыстрого охлаждения образуются крошечные кристаллы, не обнаруживаемые с помощью простого микроскопа. Эти кристаллы, очевидно, располагаются как внутри, так и вне клеток. Тем не менее, в некоторых случаях клетки сохраняют жизнеспособность. В настоящее время нельзя окончательно решить, что служит причиной гибели клеток после внутриклеточной кристаллизации — повреждения, причиненные кристаллами льда, или какое-то другое действие, связанное с кристаллизацией.
3. При медленном охлаждении в присутствии глицерина кристаллы образуются и растут в среде, окружающей клетки. Клетки не сморщиваются. При охлаждении до —45° не наблюдается никаких признаков внутриклеточной кристаллизации. Некоторые обработанные глицерином клетки замерзают изнутри при температуре от —45 до —50°. Другие остаются прозрачными и, по-видимому, не промерзают при медленном охлаждении до —79°. Образование ультрамикроскопических кристалликов возможно, но маловероятно, поскольку при медленном охлаждении обычно наблюдается образование крупных кристаллов. В некоторых случаях клетки бывают достаточно водопроницаемыми. Тогда большая часть воды выделяется в окружающую среду и там вымерзает. Одновременно в клетки проникает глицерин, и благодаря повышению его концентрации предотвращается внутриклеточная кристаллизация. В настоящее время еще не выявлено, сохраняют ли жизнеспособность обработанные глицерином клетки, замерзшие изнутри.
4. В связи с такими явлениями, как миграционная перекристаллизация, высвобождение пузырьков газа и т. п., оттаивание может быть более опасным, чем замораживание.