Факультет

Студентам

Посетителям

Наблюдение живых клеток непосредственно под микроскопом при замораживании

Много лет назад Левенгук и Спалланцани, замораживая под микроскопом каплю воды, наблюдали метавшихся в ней крошечных животных, несмотря на образование кристаллов льда.

Эти животные сохраняли активность, пока не вымерзала вся вода. Некоторые из них оживали, как только замороженную каплю воды оттаивали. Уже в наше время Чемберс и Гэйл установили, что пресноводных амеб и окружающую их воду можно переохлаждать до температуры —5°. При этой температуре наблюдались некоторые изменения формы амебы и движения жидкости внутри ее, но пелликула, по-видимому, затвердевала. Примечательно, что при температуре —1,4°, когда вода, окружающая амебу, уже замерзала, внутренняя среда ее сохраняла жидкое состояние самопроизвольно. Иногда наступала кристаллизация льда и во внутренней среде. Такое замораживание всегда можно было осуществить при температуре ниже —0,8°, проколов клеточную оболочку микропипеткой с кристалликом льда на ее конце. После такого промораживания изнутри амебы никогда не оживали.

Использование простого замораживающего предметного стекла облегчило наблюдение амеб под микроскопом при более низких температурах. Наши наблюдения подтвердили, что пресноводные амебы при температуре около —5° переохлаждались. Затем в окружающей среде появлялись кристаллы льда, которые росли до тех пор, пока полностью не окружали амеб. При этом края кристаллов были закруглены, а рост их сдерживался присутствием амеб, у которых они, по всей видимости, не вызывали никаких повреждений. Окруженные кристаллами льда амебы сохраняли свою форму и прозрачность. Когда температура достигала приблизительно —8°, внутренняя среда амебы внезапно темнела и в цитоплазме, а также в вакуолях появлялись мелкие кристаллики. Потемнение обусловливалось рассеянием света с поверхности бесчисленных кристалликов. После оттаивания клеточная оболочка обычно оказывалась разорванной в нескольких местах и цитоплазматические гранулы выпадали в окружающую среду. Удивительно, что растущие в окружающей среде кристаллы льда, по-видимому, не сдавливали амебы. Амебы выдерживали гидростатические давления, в сотни раз превышающие нормальное атмосферное давление при температуре выше нуля. Возможно, другие клетки не обладают такой устойчивостью к сдавливанию, но до настоящего времени еще не доказано, что давление ледяных кристаллов льда является летальным.

Промежуток времени между наступлением вне — и внутриклеточной кристаллизации льда у амеб составлял иногда несколько минут. Клеточные оболочки, по-видимому, были непроницаемы для льда, так же как они непроницаемы для воды при температурах выше нуля. Выделение воды, как полагают, зависит от активных метаболических процессов внутри самой клетки. При понижении интенсивности или прекращении обмена веществ, когда амебы переохлаждены, их оболочки начинают пропускать отдельные молекулы воды или даже целые агрегаты молекул, достаточно крупные, чтобы образовать центр кристаллизации льда. Не ясно, будет ли лед проникать через оболочку внутрь клетки или же молекулы воды будут выделяться из клеток, способствуя образованию кристаллов льда в окружающей среде. При относительно кратковременном изучении не было обнаружено никаких признаков изменения величины амебы после вымерзания окружающей ее среды ни при переохлаждении цитоплазмы, ни после ее замерзания. Нельзя исключить возможность попадания внутрь клетки ультра-микроскопической частицы льда. Нет вещества более водонепроницаемого, чем кутикула насекомых. И тем не менее, если на наружной поверхности переохлажденного насекомого замерзает капля влаги, все тканевые жидкости под кутикулой моментально вымерзают. Это, должно быть, какая-то форма осеменения льдом. Возможно, нечто подобное происходило и с амебами, хотя не было никаких видимых признаков связи между внутри — и внеклеточной кристаллизацией.

Если не вся, то большая часть воды, вымерзшей внутри амебы, должна была присутствовать в ней ранее и действовать как растворитель содержащихся в цитоплазме электролитов и неэлектролитов, участвующих в обменных процессах. Введенный в незамороженную амебу (при 0° или при температуре чуть ниже 0°) кристалл льда, несомненно, будет представлять собой инородное тело. Спрашивается, можно ли считать инородными телами кристаллы льда, образовавшиеся из молекул воды, уже присутствовавших внутри клетки. Меримэн и другие рассматривали их именно как инородные, и всякие сомнения по этому поводу, вероятно, лишены какого-либо смысла. Не раз утверждали, что гибель клеток и их структурный распад после внутриклеточной кристаллизации и оттаивания представляют собой непосредственный результат разрушения их кристаллами льда. В действительности же наблюдение под микроскопом процесса образования льда отнюдь не подтвердило правильности мнения, согласно которому кристаллы льда вызывают механические нарушения. Гибель клеток после замораживания изнутри приписывали также миграционной перекристаллизации, наступающей после первоначального процесса замораживания. Или же повреждения клеток могут происходить во время таяния кристаллов льда.

Препараты живых клеток или тканей млекопитающих и других позвоночных при медленном охлаждении в физиологических средах часто переохлаждаются до температуры —5°, а иногда и до —10 или —15°. После согревания таких незамороженных клеток наблюдалось следующее: волокна поперечнополосатой мышцы лягушки реагировали на раздражение, у сперматозоидов петуха восстанавливалась подвижность, эритроциты человека и других млекопитающих не имели никаких следов повреждений, а оплодотворенные кроличьи яйца нормально дробились. При замерзании кристаллы льда всегда в первую очередь образовывались в среде, окружавшей клетки, или же во внеклеточных тканевых жидкостях. Сами клетки не замерзали, хотя и были окружены кристаллами льда. Чемберс и Гэйл установили, что у мышечных волокон лягушек можно вызвать внутриклеточную кристаллизацию при температурах ниже —1,6° путем прикосновения кристаллом льда к обрезанному концу волокна. Эти авторы наблюдали быстрое распространение льда по поверхности волокна, сопровождавшееся более медленным ростом в цитоплазме столбиков ледяных кристаллов.

Когда препараты ткани семенника морской свинки погружали в раствор Рингера, в переохлажденной среде при температуре от —2 до —5° происходило самопроизвольное замораживание. Клетки оставались незамороженными, пока температура не понижалась до уровня от —6 до —12°. После этого внутри клеток образовывались кристаллики, часто настолько мелкие, что попадавший на них свет рассеивался и клетки внезапно темнели. В других опытах ледяные кристаллы внутри клеток были немного большие и пропускали какое-то количество света. При этом еще можно было различить контуры замороженных клеток. При согревании препаратов в первую очередь оттаивала среда. После таяния внутриклеточных кристаллов льда клеточные оболочки исчезали, оставляя, по-видимому, неповрежденные ядра, окруженные остатками цитоплазмы. Когда ткань семенника морской свинки закрывали силиконом, удалив как можно больше жидкости, клетки и окружающая их среда не замерзали, пока температура не достигала уровня от —5 до —10°. Иногда они оставались в состоянии переохлаждения до —20°. После этого внутри клеток образовывались кристаллы льда, которые продолжали расти до тех пор, пока температура не падала до уровня от —40 до —50°. В окружающей клетки среде ледяных кристаллов не было. После согревания препаратов клетки распадались так же, как и в препаратах, замороженных и согретых в растворе Рингера. Эти опыты имеют важное значение, поскольку они показывают, что при медленном охлаждении клеток млекопитающих внутриклеточная кристаллизация льда может наступить самопроизвольно, независимо от наличия или отсутствия видимых кристаллов во внеклеточном пространстве. При замораживании сперматозоидов млекопитающих, даже если в них образуются кристаллы льда, то вследствие исключительно малого размера клеток их нельзя обнаружить, так как эти кристаллы не могут быть разрешены имеющимися оптическими приборами. Не обнаружены также кристаллы в эритроцитах млекопитающих в промежуток времени между образованием льда в растворе Рингера и наступлением гемолиза.

В ткани семенника морской свинки, медленно охлажденной под микроскопом в растворе Рингера с добавлением 15% глицерина, кристаллы образовывались в жидкости, омывающей клетки. Сперматозоиды, сперматиды и другие клетки не подвергались изменениям даже при температуре от —45 до —50°. В этом температурном интервале некоторые более крупные клетки темнели, что указывало на образование в них кристаллов льда. Даже в самых тонких препаратах нельзя было различить, где именно образовывались кристаллы — в ядре или в цитоплазме. На протяжении 15—20 мин, пока температура понижалась до —79°, а часто и в течение последующих 20 мин при этой температуре большая часть клеток оставалась светлой и по внешнему виду казалась незамороженной. После оттаивания препаратов клетки, в том числе и кристаллизовавшиеся изнутри, оказывались неповрежденными и никаких признаков распада не отмечалось. В опытах с эпителием роговицы также отмечено, что медленно охлаждаемые до —79° клетки роговицы, предварительно обработанные глицерином, сохраняли прозрачность и, по-видимому, не замерзали. К сожалению, не удалось установить, сохранили ли они жизнеспособность. В препаратах ткани семенника с большим количеством жидкости хвосты сперматид были подвижными до и после замораживания, но благодаря наличию кристаллов в среде трудно было определить, какие клетки замерзли изнутри. Полученные весьма важные результаты показывают, что в присутствии глицерина внутренняя среда некоторых клеток хотя бы непродолжительное время остается незамороженной при столь низких температурах, как —79°. Возможно, клетки семенников проницаемы и для воды и для глицерина, и во время замораживания среды вода выходит из клеток в окружающий их остаточный гипертонический раствор и затем превращается в лед и наращивает образовавшиеся вне клеток кристаллы. Одновременно глицерин проникает в клетки, так что его концентрация внутри клеток все повышается, и, в конечном счете, клетки, вероятно, не могут замерзнуть вследствие сильного обезвоживания. Конечно, не исключена возможность образования ультрамикроскопических кристаллов.

Рэ, используя специально сконструированный микроскоп с приспособлением для регулирования и измерения температуры, очень быстро охлаждал фибробласты мышей линии L. В окружающей среде и внутри клеток одновременно образовывались мелкие кристаллики. В процессе медленного согревания при температуре выше —40° наступала миграционная перекристаллизация, в результате которой мельчайшие внутриклеточные кристаллики увеличивались в размере и при —20° клетки разрушались. Судя по внешнему виду клеток, их разрушение, по-видимому, было обусловлено образованием новых кристаллов. Как подчеркивали Сколендер и сотрудники, основная трудность экспериментального замораживания животных в воде заключается в том, что газы попадают в лед, образуя маленькие пузырьки, и вызывают повреждения во время оттаивания. Такие пузырьки образуются также в замороженных тканях и могут привести к разрушению клеток при оттаивании.

Ткани насекомых замораживали при непосредственном наблюдении под микроскопом. При медленном охлаждении сердец устойчивых к замораживанию предкуколок Монета flavescens кристаллы льда образовывались вне клеток, и сердца после оттаивания начинали сокращаться. При более быстром охлаждении происходила внутриклеточная кристаллизация и сердца после оттаивания уже не сокращались. Сколендер, однако, полагает, что было бы неправильным безапелляционно заявлять, что внутриклеточное замораживание неизбежно влечет за собой гибель клеток. Солт недавно показал, что крупные клетки жирового тела золотарниковой мухи-пестрокрылки (Eurosta solidagims Fitch) переживают внутреннее замораживание при температурах от —15 до —25°. Единственное видимое изменение после оттаивания заключалось в слиянии капелек жира внутри клеток. То же наблюдалось и в клетках интактных личинок, которые переживали многократное замораживание и оттаивание или же продолжительное замораживание в естественных условиях. Вряд ли можно сомневаться в том, что внутриклеточная кристаллизация в клетках жирового тела этих насекомых представляет собой вполне обычное явление. Остается лишь выяснить, образуются ли кристаллы льда внутри клеток в других тканях или животных, переживающих замораживание.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: