Глицерин и некоторые родственные ему многоатомные спирты защищают живые клетки от губительного действия замораживания и оттаивания.
В связи с этим возникла мысль о возможности изменения с помощью этих веществ характера повреждений, наступающих при замораживании и оттаивании сред, в которых взвешены живые клетки.
При охлаждении (с непосредственным наблюдением под микроскопом) тонких пленок раствора Рингера с взвешенными в нем сперматозоидами при температуре от 0 до —8° начиналась кристаллизация льда. Кристаллы быстро росли в виде пластинок и многоугольников, а иногда и копий с тупыми концами, которые разрастались в ширину и в длину. Все эти кристаллы как бы подталкивали впереди себя сперматозоиды, пока температура не достигла примерно —20°. Теперь между крупными кристаллами оставались только очень узкие щели, забитые живыми клетками. При согревании проб кристаллы при температуре от —10 до —2° заметно уменьшались по величине и между ними появлялись пузырьки и щели. Когда последние кристаллы льда исчезали, можно было наблюдать, как сперматозоиды располагались вдоль контуров тех пространств, которые ранее были заняты кристаллами. Бели сперматозоиды взвешивали в растворе Рингера, содержащем 15—20% глицерина, замораживание наступало при температуре от — 10 до —20°. Кристаллы имели форму пера или листьев папоротника с центральным стержнем, от которого они расходились лучами. При температуре —40° между кристаллами были отчетливо видны каналы, в которых располагались клетки. При согревании кристаллы оттаивали постепенно, и этот процесс протекал не так бурно, как при согревании в отсутствие глицерина. Глицерин явно видоизменял течение процессов замораживания и оттаивания среды. Ниже мы рассмотрим механизм защитного действия глицерина, предохраняющего сперматозоиды, эритроциты и другие клетки и ткани от повреждений во время образования и таяния льда.
Люйет с помощью более совершенного прибора изучал формы микроскопических кристаллов льда, образующихся в присутствии глицерина. Он подтвердил, что кристаллы льда распространены в виде древовидных образований с тупыми концами, между которыми пролегают широкие каналы. Когда тонкие пленки 3 М раствора глицерина охлаждали со скоростью 300—4200° в 1 сек, число центров кристаллизации неизменно увеличивалось. Никаких признаков витрификации даже при самых высоких скоростях охлаждения не наблюдалось. При медленном охлаждении растворов сахарозы также появлялись ветвящиеся кристаллы льда, отходящие от центрального ствола. При более быстром охлаждении кристаллизация шла в радиальном направлении, а при сверхбыстром охлаждении до очень низких температур появлялись быстро исчезающие шаровидные диски. Препарат имел вид «остекленевшего», но только в смысле его прозрачности, а не отсутствия в нем кристаллов.
Интересные исследования о распространении льда в биологических средах и системах провели Лузена и Кук. Когда растворы с глицерином и сахарозой охлаждали медленно, кристаллизация начиналась в точке замерзания. При быстром же охлаждении кристаллы появлялись только после падения температуры ниже точки замерзания. Следовательно, растворы, по-видимому, переохлаждались. Последующий рост кристаллов льда значительно задерживался в присутствии глицерина или других многоатомных спиртов и сахаров. Лузена указывал, что концентрация этих растворенных веществ постепенно повышалась по мере вымерзания воды, вследствие чего и происходила задержка роста кристаллов после падения температуры.
Считается, что точка замерзания чистого глицерина лежит приблизительно при +18°, но его редко можно наблюдать в кристаллическом состоянии. Отчасти это обусловлено выраженной способностью глицерина к переохлаждению, а отчасти — его чрезвычайно сильной гигроскопичностью. Присутствие небольших количеств воды значительно понижает точку замерзания глицерина и препятствует его кристаллизации. Глицерин растворяется в воде в любом соотношении при температуре выше 0°. Он растворяется также в водных растворах всех электролитов и неэлектролитов, обычно присутствующих в физиологических средах. Кроме того, глицерин сам по себе служит хорошим растворителем электролитов и других компонентов этих сред. Точки замерзания растворов с различными концентрациями глицерина определены Сегюром. Как мы уже говорили, эти растворы имеют сильно выраженную способность к переохлаждению. Если концентрация глицерина меньше 66,7% (по весу), то внесение в раствор кристалла льда обеспечит выпадение кристаллов льда при точке замерзания раствора. Самая низкая температура, при которой система содержит воду, лед и глицерин, составляет —46,5°. Это — эвтектическая точка раствора, состоящего из 66,7 весовой части глицерина и 33,3 весовой части воды. Без внесения кристалла глицерина вряд ли удастся вызвать выпадение кристаллов глицерина из раствора в эвтектической точке или при более низких температурах или же из растворов, содержащих более 66,7% (по весу) глицерина. Скорее глицерин и в присутствии льда останется в состоянии переохлаждения. Если даже процесс кристаллизации глицерина и наступит при температуре —46,5° и ниже, он будет протекать очень медленно. Сегюр говорит, что скорость кристаллизации переохлажденного глицерина в пробирке диаметром 10—12 мм при температуре ниже —43° не превышала 0,0001 мм в 1 мин.
При температурах выше 0° переохлажденный глицерин отличается высокой вязкостью, причем его вязкость достигает примерно 1013 из по мере падения температуры до —89°, когда он затвердевает. Данные о вязкости глицерина при различных температурах приводит Сегюр. Он определил также вязкость водных растворов с различной концентрацией глицерина при температурах ниже —40°. Полученные высокие величины позволяют предполагать, что в присутствии глицерина при низких температурах диффузия происходит очень медленно и соответственно понижается скорость физических и химических процессов. Такое соображение может играть большую роль в вопросе о хранении живых клеток при температурах ниже нуля. Кроме того, растворы с высокой концентрацией глицерина не теряют текучести, несмотря на наличие в них кристаллов льда, при температуре —41,5°. Превращение вязкой жидкости в твердую стекловидную массу происходит только тогда, когда чистый глицерин переохлажден до температуры ниже —83°. Не установлено, влияет ли присутствие электролитов или неэлектролитов на образование «стекловидного» глицерина и имеет ли оно какое-либо значение для хранения живых клеток в потенциально жизнеспособном состоянии.
Много исследований посвящено воздействию глицерина на электролиты в физиологических средах при различных температурах во время замораживания и оттаивания. Так, Рэ разработал специальную методику для изучения термодинамических изменений и электропроводности. Он обнаружил, что при охлаждении уравновешенного солевого раствора Эрла, содержащего 30% глицерина, до —60° удельное сопротивление постепенно повышалось, а при его согревании понижалось таким образом, что обе полученные кривые изменения удельного сопротивления можно наложить друг на друга. Эти результаты находились в явном противоречии с данными, полученными при определении удельного сопротивления во время замораживания и оттаивания раствора Эрла, не содержавшего глицерина. Внезапное резкое повышение удельного сопротивления при температуре около —40° во время замораживания такого раствора, по-видимому, объяснялось полным исчезновением жидкой фазы, которое в присутствии глицерина могло происходить только при температуре ниже —60°. Кривая изменения удельного сопротивления при согревании не содержащего глицерина раствора хлористого натрия резко отличалась от кривых, полученных при охлаждении данного раствора, как с примесью глицерина, так и без него. Пока температура не повышалась до —35°, не было никаких признаков понижения удельного сопротивления. На уровне —22° отмечалось резкое падение, а затем от температуры —20 до 0° удельное сопротивление понижалось уже постепенно. Резкое его падение во время оттаивания предположительно наступает в эвтектической точке хлористого натрия, являющегося главным (по объему) компонентом раствора Эрла. Эвтектическая точка совершенно не была обнаружена при определении удельного сопротивления содержащих глицерин растворов во время их замораживания при —60° или последующего оттаивания. При этом поражала исключительная закономерность и полная обратимость кривых.
Термодинамические изменения изучали с помощью дифференциального термического анализа при согревании физиологических сред и сред, содержавших глицерин. Во время оттаивания 1-процентного раствора хлористого натрия в дистиллированной воде при температурах от —22 до —21°, т. е. в том интервале, в котором эвтектическая смесь таяла, отмечалось заметное поглощение тепла. В присутствии глицерина постепенное таяние начиналось при температурах от —27 до —20°. Разрыв в температуре исследуемого раствора и дистиллированной воды (в соседних пробирках, помещенных в один и тот же сосуд с охлаждающей смесью) заметно увеличился. Наличие в среде глицерина обусловливает также существенные изменения теплопроводности при температурах от —80 до —20°. Рэ полагает, что имеются данные о таянии эвтектической смеси глицерин — вода — соль при температурах от —65 до —55°, после чего наступает постепенное таяние льда. Термодинамические изменения происходят также и в содержащих глицерин смесях при температурах от —80 до —160°, но не при —190°. Следовательно, полная физическая стабилизация растворов глицерина наступает только при температуре жидкого азота.
Особые свойства глицерина при низких и очень низких температурах не могут оказывать влияния на последующую выживаемость живых клеток, если эти клетки уже погибли ранее в результате изменений, наступивших в среде во время замораживания и оттаивания при сравнительно высоких температурах (ниже 0°). Существует критический температурный интервал, в пределах которого в клетках млекопитающих, замороженных в физиологическом растворе или в других средах, не содержащих глицерина, происходят повреждения. Для эритроцитов человека этот интервал составляет от —3 до —40°, для бычьих сперматозоидов — от —1,5 до —30°. Лавлок с помощью простых физико-химических методов изучал действие глицерина и других нейтральных растворенных веществ на среду в этом температурном интервале. Первое наиболее явное влияние глицерина на физиологический раствор заключается в понижении температуры замерзания. Это обусловлено просто самим присутствием молекул глицерина, благодаря которому молекулы воды отделяются друг от друга в еще большей степени, чем они уже были отделены в результате присутствия молекул хлористого натрия, и требуется дальнейшее понижение температуры, чтобы молекулы воды смогли образовать характерную для льда структуру. Такое же действие оказывают и другие нейтральные растворенные вещества. Понижение температуры замерзания Т можно рассчитать по формуле Т = К(2х+у), где х и у — концентрации соответственно хлористого натрия и нейтрального растворенного вещества. Если концентрации выражены в моляльных единицах или в мольных долях, то К будет постоянной величиной, отражающей наблюдаемое понижение температуры замерзания водных растворов хлористого натрия или какой-либо другой соли на единицу концентрации нейтрального растворенного вещества. Величина К может слегка варьировать в зависимости от природы и от концентраций растворенных веществ. Поскольку лед выпадает в чистом виде, концентрации соли и нейтрального растворенного вещества в процессе замерзания соответственно повышаются.
Лавлок определял состав жидкой фазы при замораживании растворов, содержащих 0,16 М NaCl и различные концентрации глицерина. Полученные им результаты показывают, что повышение исходной концентрации глицерина приводит к понижению концентрации хлористого натрия, находящегося в состоянии равновесия со льдом, при любой температуре ниже точки замерзания раствора. Такое же влияние оказывает любое другое нейтральное растворенное вещество, в том числе и диметилсульфоксид, который не относится к многоатомным спиртам. Снижение точки замерзания и дальнейшее падение температуры, необходимое для того, чтобы концентрация электролитов достигла определенного уровня, представляет собой пример проявления коллигативных свойств любых растворов. Уменьшение концентрации электролитов в исходном растворе влечет за собой понижение их концентрации при любой температуре во время замораживания в присутствии определенного количества нейтрального растворенного вещества. Их концентрация во время замораживания определяется исходным соотношением между числом молекул различных веществ в данном растворе.