Факультет

Студентам

Посетителям

Действие низких температур на среды, содержащие белки

Наилучшими средами для многих целей являются разбавленные или не разбавленные плазма или сыворотка.

Прочие среды содержат сывороточный или какой-либо иной альбумин или же другие белки, включая желатин, растворенные в солевых растворах. В связи с этим возникла необходимость изучения различных сторон воздействия белков на процесс замораживания в разбавленных водных средах. Так, Лузена показал, что присутствие в низкой концентрации альбумина сильно задерживает рост кристаллов льда в воде и в растворах неорганических солей. Повышение концентрации свыше 10% давало слабый эффект.

Исключительный интерес представляют исследования Люйета, который при помощи специального замораживающего микроскопа наблюдал образование кристаллов льда в тонких пленках растворов с высокой концентрацией бычьего альбумина и в гелях, содержащих 30—50% желатины, при разных скоростях замораживания. При этом ему удалось сфотографировать призмы, звезды, розетки и шестиугольные кристаллы разнообразной формы, образовавшиеся в тонких пленках 35-процентиого раствора бычьего альбумина, замороженных при —3°. Когда препараты замораживали при более низких температурах и, следовательно, с большей скоростью, гексагональная симметрия узора кристаллов несколько нарушалась и образовывались неправильные розетки.

Люйет установил, что при сверхбыстром охлаждении тонких пленок гелей, содержащих 30—50% желатины, или растворов с высокой концентрацией других белков кристаллизация проходила в виде появления тончайшей легкой дымки, покрывавшей весь препарат. Эта дымка постепенно бледнела, и вскоре вся пленка при рассмотрении ее под обычным микроскопом оказывалась прозрачной. Люйет назвал кристаллы такого типа «быстроисчезающими шарообразными дисками». Не ясно, происходила ли здесь истинная кристаллизация или же пленки витрифицировались. В настоящее время Люйету удалось доказать, что пленка желатины после сверхбыстрого охлаждения имеет кристаллическую структуру, сохраняя внешне вид прозрачного аморфного вещества. Люйет зарегистрировал за кратковременный период охлаждения временное повышение температуры в препарате. Это повышение температуры совпадало с моментом появления и распространения тончайшей дымки, о которой говорилось выше. При согревании в результате перекристаллизации прозрачная пленка становилась мутной. Меримэн для изучения прозрачных пленок, образующихся при сверхбыстром охлаждении гелей желатины, использовал дифракцию рентгеновских лучей. Рентгенограммы показали присутствие кристаллов, отражавших рентгеновские лучи под одним углом. После перекристаллизации, наступавшей во время согревания, рентгеновские лучи отражались под тремя углами.

На основании описанных наблюдений был сделан один важный вывод. Стекловидное вещество, образующееся в результате сверхбыстрого охлаждения до очень низких температур, содержит мельчайшие кристаллики льда. Это не истинное стекловидное вещество, являющееся аморфным, с беспорядочным расположением молекул. Микроскопические препараты живых клеток и тканей, переживших сверхбыстрое охлаждение до очень низких температур, которые раньше считали витрифицированными, вероятно, содержали такие кристаллики. Люйет подчеркивает, что надо с величайшей осторожностью употреблять такие термины, как «стекловидный», «остекленение» («витрификация»), «остекленевший», «расстекленение» («девитрификация»). Назрела необходимость в новой терминологии, однако введение этих новых терминов в настоящее время может усугубить путаницу.

Люйет различает четыре фактора, которые теоретически могут препятствовать процессу кристаллизации при быстром охлаждении: 1) уменьшение числа центров кристаллизации; 2) замедление роста кристаллов из центров; 3) уменьшение всего общего количества образовавшегося льда; 4) ухудшение степени «упорядоченности» молекул. Он показал экспериментально, что повышение скорости охлаждения разбавленных водных растворов не препятствовало образованию центров кристаллизации. Наоборот, число их увеличивалось при ускорении охлаждения с 300 до 1200° в 1 сек. Не было также никаких признаков замедления роста кристаллов при повышенных скоростях замораживания 40-процентных гелей желатины. Соотношение между скоростью охлаждения и количеством образовавшегося льда не было определено. Рентгенографические исследования показали, что кристаллизация начиналась при охлаждении 30-процентного раствора желатины со скоростью нескольких тысяч градусов в 1 сек. Таким образом, имело место хотя бы частичное «упорядочение» молекул.

Некоторые ферменты и многие другие белки, растворенные в физиологических солевых средах, переносят продолжительное хранение в замороженном состоянии и последующее согревание, не дегенерируя и не утрачивая характерных свойств. Лецито-вителлин же, основной липопротеид яичного желтка, наоборот, быстро дегенерирует при замораживании и оттаивании. На это указывает утрата текучести яичным желтком, замороженным при температуре ниже —6°. Лецито-вителлин осаждается также и при замораживании физиологической солевой среды, в которой его развели. Из комплекса липопротеидных молекул выпадает липид. При быстром замораживании раствора при очень низкой температуре с последующим быстрым согреванием повреждения наступают не так скоро. Весьма примечательно, что потеря растворимости лецито-вителлином в растворах хлористого натрия и выпадение липидов наступают при —3° раньше, чем при —20°, При температуре —20° концентрация солей в частично замороженной среде очень высока (около 30 г на 100 г воды). Таким образом, повреждения, наступающие во время замораживания, нельзя приписать действию концентрации соли. В то же время лецито-вителлин повреждается, если pH суспензионной среды падает ниже 5,2, а это может происходить при замораживании забуференных физиологических солевых сред. Реакция липовителлина на замораживание обсуждается в работе Лавлока.

Другим белком, который, как известно, повреждается при замораживании, является бета-липопротеид человеческой плазмы. Денатурация его выражается прежде всего в том, что он перестает растворяться в физиологическом растворе. Лавлок замораживал на разное время и при различных температурах растворы бета-липопротеида в 0,16 М хлористом натрии. Затем он их оттаивал и регистрировал наименьшую продолжительность замораживания, требуемую для появления первых признаков помутнения. Результаты опытов показали, что при —18° признаки денатурации появились только через 10 дней, при —20° — через 1 сутки, а при —33° — уже через несколько минут. Изменения в белке явно происходили быстрее при температурах ниже эвтектической точки хлористого натрия. p-Липопротеид в насыщенном растворе хлористого натрия при 0° почти не утрачивал своей растворимости. Влияние изменения величины pH испытывали путем сравнения повреждений, происшедших в тех случаях, когда забуференные при различных pH растворы бета-липопротеида замораживали при —40°. Полученные результаты показывали, что имели место более выраженные отклонения pH раствора от нормы, но они все же не были единственной причиной денатурации. Затем липопротеид растворяли в растворах других солей с эвтектическими точками от —4 до —86°. Растворы охлаждали, выдерживали 15 час при —40° и оттаивали. Наиболее тяжелые повреждения были в растворах с самой высокой эвтектической точкой, а наиболее легкие — в тех случаях, когда эвтектическая точка лежала ниже —40°. Следовательно, денатурация, по-видимому, зависит от вымерзания воды из раствора и бывает особенно выраженной, когда вымерзают последние остатки воды. Это может привести к физическому соприкосновению отдельных молекул липопротеида и даже к вымерзанию некоторых обычно ассоциированных с ним молекул воды. Высушивание как при нормальной температуре, так и после частичного замораживания тоже влечет за собой денатурацию р-липопротеида плазмы. Это подтверждает предположение, что причиной повреждения во время замораживания служит исчезновение даже следов воды, превратившейся в лед.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: