Факультет

Студентам

Посетителям

Трансформация гумусовых веществ

Органическое вещество почвы имеет сложный и неоднородный состав.

Оно является динамической системой, непрерывно обновляющейся в результате новообразований, разложения входящих в ее состав веществ и трансформации их под воздействием микроорганизмов. Благодаря органическому веществу почва заселена многочисленными микроорганизмами, с которыми связаны сложные и разнообразные биохимические процессы. Живое вещество обусловливает тот биологический круговорот веществ и энергии, благодаря которому возможно существование жизни на земле.

Групповой состав органического вещества торфяных почв в настоящее время подробно изучен. Содержание отдельных групп зависит от видового состава исходных растений, степени разложения торфа и находится в пределах (в % на органическое вещество): битумы — 1,6—6,7; водорастворимые вещества при температуре 50 °С — 0,4-2,0, при 100 °С — 1,5—4,1; легкогидролизуемые вещества — 6,1—21,3; гуминовые кислоты — 26,7—47,6; фульвокислоты — 5,9—19,6; трудногидролизуемые соединения — 2,3—13,5; целлюлоза — до 5,0; негидролизуемый остаток (лигнин) — 4,8—29,8.

Гумусом почвы называют органическое вещество, утратившее тканевое строение. В составе гумуса различают специфические (или гумусовые) вещества и неспецифические органические соединения, являющиеся продуктами разложения органических остатков или жизнедеятельности растительных и животных организмов.

Гумусовые вещества гетерогенны по составу и представляют собой полимеры, основными единицами которых служат ароматические структуры фенольного типа и азотсодержащие соединения — аминокислоты и пептиды, а также некоторые углеводы. Ароматические соединения фенольного типа составляют углеродную сетку, ароматическое ядро молекулы гуминовой кислоты. Среди продуктов расщепления гуминовых кислот найдены производные фенолов и хинонов, поли — и гетероциклические соединения, циклические альдегиды и кислоты. В них содержатся также соединения типа индола, пиримидин, пурины, являющиеся производными нуклеиновых кислот.

Аминокислотный состав периферической части гуминовых кислот отражает состав аминокислот растительных и микробных остатков. В составе гидролизатов гуминовых кислот почв обнаружено до 16 аминокислот, в том числе циклических.

В сложном спектре органических веществ почвенного гумуса центральное место занимают гумусовые кислоты — гуминовые и фульвокислоты, связанные взаимными переходами. Их особая роль определяется термодинамической и биохимической устойчивостью и многообразием функций. Они придают почвам стабильность, буферность, определенный биохимический фон. И хотя неспецифические компоненты гумуса, часто более активные и лабильные, могут отражать конкретную биохимическую ситуацию в определенный отрезок времени, именно с гумусовыми кислотами связаны важнейшие типовые признаки почв. Вместе с тем гумусовые кислоты являются резервуаром, обменным фондом неспецифических соединений.

Низинные торфяные почвы характеризуются высоким содержанием гумусовых веществ, а в их составе гуминовых кислот. По данным, в хорошо разложившихся торфах низинного типа их содержание доходит до 70—80%. Плодородие почв в значительной мере определяется их физическими и физико-химическими свойствами, количественным и качественным содержанием гуминового комплекса.

По свойствам специфические гумусовые вещества делят на три большие группы: гуминовые кислоты, фульвокислоты и гумин. Эту схему деления гумусовых веществ различные исследователи часто дополняют, вводя более дробное деление, например гиматомелановые кислоты, гуминовые кислоты, бурые и серые, А, В, P-типа и прочие. Как гуминовые, так и фульвокислоты удается разделить на фракции, отличающиеся рядом свойств, элементным составом, растворимостью, электрофоретической подвижностью, оптической плотностью. По данным радиоуглеродного метода, в гумусовых кислотах наряду с молодыми, современными фракциями содержатся фракции тысячелетнего возраста.

По последним представлениям, гуминовые кислоты в почвах находятся в двух формах: лабильной части, включающей растительные остатки и большую часть продуктов их гумификации, и стабильной, нативной, непосредственно связанной с процессами почвообразования. Первая форма является активной и составляет не более 1/3 органического углерода почвы, вторая — инертной. Минерализации подвергается только лабильная форма органического вещества, стабильная же форма гумуса выключена из круговорота веществ и не поддается воздействию микроорганизмов. Устойчивость разных фракций гумуса к воздействию микроорганизмов многие авторы связывают с химической «молодостью» гуминовых кислот и присутствием в их структуре большого количества функциональных групп. Гуминовые кислоты почв разного типа содержат в различных соотношениях несколько фракций с различными молекулярными массами. Д. С. Орлов отмечает, что разные фракции гуминовых кислот торфа с молекулярными массами от 9000—10000 до 68000—74000 удалось выделить только Н. Н. Бамбалову. В настоящее время группу гуминовых кислот разделяют на подгруппы черных (серых), бурых гуминовых и гиматомелановых кислот. Наряду с различиями в элементном составе, растворимости, оптической плотности соединений этих подгрупп они четко отличаются по содержанию углерода: более обуглероженные гуминовые кислоты называют серыми, менее обуглероженные — бурыми. В пределах группы гуминовые кислоты сохраняют общий принцип строения, а их высокомолекулярный характер обусловливает практическую независимость важнейших физических и химических свойств относительно небольших изменений состава.

Для диагностики гуминовых кислот Д. С. Орлов предложил использовать комплекс признаков, из которых основными являются:

1. Содержание углерода (в пределах 46—62% для гуминовых кислот и 45—65% для фульвокислот).

2. Содержание азота от 3 до 6%. Наличие негидролизуемого или гуминового азота в количестве 25—55% от общего.

3. Специфический характер электронных спектров поглощения при условии, что е-величины 0,001 %-ных растворов при длине волны 465 нм находятся в пределах 0,01 — 0,20, если толщина поглощающего слоя равна 1 см.

4. Специфический характер инфракрасных спектров поглощения в диапазоне 2—10 мкм.

В настоящее время инфракрасные или молекулярные спектры гуминовых кислот рассматриваются как один из их объективных диагностических признаков. При сравнительном изучении ИК-спектров гуминовых кислот почв различных типов четко выявлены общие черты построения этих соединений, которые характеризуют как препараты гуминовых кислот, так и нативные почвы, подтверждая их общность.

Наряду с общностью гуминовых кислот как особого класса соединений ИК-спектры позволяют выявить и некоторые их особенности. ИК-спектры поглощения относительно подробно изучены в интервале длин волн от 2,5 до 10—12 мкм (4000—800 см-1). В этой области спектра отчетливо проявляются полосы поглощения, обусловленные присутствием в молекулах гуминовых и фульвокислот ряда атомных группировок. Идентифицированы полосы, относимые к СН, СН2, СН3, ОН, СООН-группам, установлено поглощение за счет двойных С = С связей ароматических соединений, а также полос поглощения, связанных с ароматическими СН-группами, а также с группами NH4, NH2, C = N и др. Выявлены структурные особенности гуминовых кислот, связанные с типом почвообразования и растительности.

Процессы формирования гумуса в почве тесным образом связаны с деятельностью микроорганизмов, интенсивность и направление которой определяется комплексом условий почвообразования — гидротермическим режимом, физическими условиями, структурой почвы, ее химическим и микробиологическим составом. Основным показателем характера и интенсивности гумификации (как и минерализации в целом) органического вещества является биологическая активность почв. В литературе отмечена связь состава гумуса, численности микрофлоры, дыхания и ферментативной активности почв.

В последнее время очень широко обсуждается возможность прямого участия пигментов почвенных микроорганизмов в формировании гумусовых кислот. По содержанию углерода они не выходят за пределы, установленные для гуминовых кислот (в некоторых случаях фульвокислот). Однако для пигментов микроорганизмов характерны резкие колебания содержания азота — от 1,2 до 11%, т. е. ниже и выше пределов, принятых для гумусовых кислот. Д. С. Орлов считает, что пигменты, накапливающиеся в клетках и культуральной жидкости микроорганизмов, можно рассматривать как полупродукты, участвующие в биосинтезе, а образование меланоидов — как одну из первых стадий гумификации, необходимым звеном в синтезе азотсодержащей части гумусовых кислот.

При анализе гумуса почв основных типов М. М. Кононова пришла к выводу, что как высокая, так и слабая «биогенность» почвы не способствует накоплению гумуса. Максимальное его содержание соответствует некоторому среднему количеству микроорганизмов, когда обеспечивается новообразование гумусовых веществ и вместе с тем процессы разложения их не носят бурного характера.

Накопление гумуса в почве определяется соотношением интенсивности двух процессов: новообразования и разложения гумусовых веществ. Сохранение гумусовых веществ в почве на более или менее продолжительный период времени либо вовлечение их в новые биологические процессы и разложение до конечных продуктов минерализации в значительной степени зависят от деятельности почвенной микрофлоры.

При торфообразовательном процессе в условиях избыточной влажности и недостаточной аэрации происходят неполное разложение и гумификация остатков растений-торфообразователей, накопление органического вещества торфа. Осушение и сельскохозяйственное использование торфяных почв активизируют микробиологические процессы, приводят к минерализации торфа, уменьшению его количества и увеличению зольности. Следствием повышения биологической активности почвы является быстрое разрушение прежде всего неспецифических и наиболее простых гумусовых веществ. Более доступны микроорганизмам «молодые» гуминовые и фульвокислоты, что согласуется с повышенным содержанием азота в прогумусовых веществах. Они быстро используются микроорганизмами, разрушаются, обновляются. В результате отщепляются боковые цепи гуминовых кислот, происходит обуглероживание их молекул, накопление наиболее устойчивых структур. Этим объясняется обуглероженность гуминовых кислот торфа и широкое отношение Сгк : Сфю достигающее в торфе 3,5 и более. Фульвокислоты, разлагаемые почти полностью, быстро обновляются, поэтому они представлены наиболее молодыми и наименее обуглероженными формами. Это характерно для почв с повышенной биологической активностью (черноземы). В дерново-подзолистых почвах благодаря пониженной биохимической активности гуминовые кислоты обогащены периферическими боковыми цепями, фульвокислоты накапливаются в сравнительно больших количествах. В торфяных почвах, по Д. С. Орлову, должны преобладать не окислительные, а восстановительные механизмы распада. Указанная схема определяет общее направление процесса; устойчивость гумусовых веществ зависит не только от биологических факторов почвы, но и от ряда других — длительности воздействия на гумусовые вещества, минералогического состава почвы, химического состава исходных торфообразователей (для торфяных почв).

При гумификации лигнинсодержащих тканей образуются гумусовые вещества, обогащенные ароматическими фрагментами, при гумификации тканей, богатых полисахаридами, в составе гумусовых веществ преобладают углеводно-полипептидные структуры. Биохимическая устойчивость указанных фрагментов различна, поэтому в процессе эксплуатации торфяных почв происходит постепенное изменение фракционного состава, структуры и свойств гумусовых веществ. В конечном итоге это обусловливает различия в дифференциации профиля почв с неодинаковым ботаническим составом торфа. Различиями в химическом составе исходных торфообразователей обусловлена также двойственная природа самой макромолекулы гуминовых кислот. В связи с этим высказывается мнение, что отдельные фрагменты в пределах одной макромолекулы могут разрушаться с неодинаковой скоростью.

По поводу устойчивости гумусовых веществ к воздействию микроорганизмов высказаны различные точки зрения. Большинство исследователей пришли к выводу о том, что гуминовые кислоты ограниченно используются микроорганизмами в качестве источников азота и углерода. Причина такой устойчивости, очевидно, кроется в многообразии связей между структурными единицами молекулы, а также обусловлена ароматическим строением ее ядра и сферической формой. Интенсивность процесса повышается при добавлении в среду доступных форм углерода и азота.

С различиями в химическом составе кислот и биологической активностью почв связана устойчивость гуматов, выделенных из почв разного типа. Наибольшая устойчивость к микробному воздействию отмечалась для гуматов каменного угля и сероземов в сравнении с гуматами, выделенными из дерново-подзолистых почв и низинного торфа.

Вопрос о механизме использования гуминовых кислот микроорганизмами дискуссионный. Одни исследователи считают, что микрофлора отщепляет лишь боковые цепи молекулы гуминовой кислоты углеводно-полипептидной природы и не затрагивает ее ядро, другие — что микрофлора способна разрушить ароматическое ядро гуминовых кислот. С. Н. Виноградский придавал большое значение в минерализации гумусовых веществ специфической автохтонной микрофлоре, способной к осуществлению этого процесса. Впоследствии это положение получило развитие в работах Е. З. Теппер, включившей в состав микрофлоры представителей родов Nocardia, Micromonospora, Bactoderma и ряд других неидентифицированных микроорганизмов.

Способность нокардий использовать гуминовую кислоту и родственные ей соединения позволила сделать вывод о специфичности их обмена веществ, ферментного аппарата и дыхания. По мнению автора, слабо выраженная протеолитическая активность и отсутствие у многих видов нокардий гидролитических ферментов (протеиназы, амилазы, инвертазы) ограничивают их участие в ассимиляции свежих органических остатков в условиях почвы. На долю нокардий выпадает использование наиболее устойчивых продуктов распада — восков, углеводородов, лигнина и его производных. При этом интенсивность дыхания нокардий очень низка — лишь в незначительной степени превышает эндогенную энергию. Это свидетельствует об индивидуальном характере ферментов, осуществляющих окисление гуматов.

Е. З. Теппер и другие авторы придают особое значение наличию у нокардий и некоторых представителей бактерий, использующих гуминовые вещества почвы, активной нитратредуктазы. С помощью этого фермента микроорганизмы восстанавливают нитратные соединения до нитритных, которые используют в низких концентрациях как источник азота. По мнению Е. З. Теппер, нитриты для этой группы микроорганизмов играют не только физиологическую, но и экологическую роль. Последнее основано на способности нитритов ингибировать развитие микрофлоры, участвующей в процессах разложения свежих органических остатков (зимогенной микрофлоры).

Многочисленные работы последних лет, выполненные с использованием изотопного метода, гельфильтрации, ИК-спектроскопии и других, позволили обнаружить участие в трансформации гумусовых кислот более широкого спектра почвенных микроорганизмов. Участие низших грибов и актиномицетов в трансформации гуминовых кислот обнаружили Н. Hippe, A. Dubovska с соавт., К. Денбош. Д. И. Никитин, Е. И. Андреюк указывают на способность представителей бактерий рода Pseudomonas использовать гуминовую кислоту. В процессе культивирования микроорганизмов на среде с гуминовой кислотой, меченной по 15N, активно накапливали биомассу спорообразующие микроорганизмы. Методом гельфильтрации на сефадексе доказано, что при культивировании бактерий из родов Pseudomonas и Bacillus на средах, содержащих гуминовые кислоты, увеличилось содержание низкомолекулярных и уменьшилось содержание высокомолекулярных фракций гуминовых кислот, что говорит о деградации гуминовых кислот почвенными микроорганизмами. Данные последних лет показали, что естественные ассоциации микробов вызывают более интенсивный процесс разрушения гуминовых кислот, чем чистые культуры. Немаловажную роль здесь играют олигонитрофильные микроорганизмы, развивающиеся в почве в виде естественных комплексов.

Большое количество работ проведено по определению условий, при которых активизируется микробиологическое разложение гуминовой кислоты. Получены данные, подтверждающие эффект при внесении в жидкие питательные среды дополнительных источников углерода и азота, зависимость процесса от вносимой дозы.

Вопросу участия микроорганизмов в синтезе гуминовых кислот посвящена обширная литература, в которой авторы с помощью разных подходов доказывают, что синтез гумусовых веществ тесно связан с развитием микроорганизмов и последующим автолизом их клеток. Присутствие компонентов микробных клеток, меченных 14С и 15N в различных фракциях гумуса, подтверждено многочисленными данными. Фрейтаг и Игель [142, 143] добавляли в почву биомассу микроорганизмов, меченную 14С и 15N, и через короткий срок обнаруживали метки в составе гумусовых веществ. Меченый углерод внесенного в почву азотобактера был выявлен в составе гумусовых кислот, а 14С — гриба Aspergillus niger в составе гумина.

По мнению М. Боттнера с соавт., основной материал внесенной микробной массы включается в состав гумуса и только 22—24% углерода микробных клеток подвергается минерализации. Многие авторы отмечают накопление гумусовых веществ в условиях, способствующих нарастанию большой микробной биомассы (например, при внесении в почву различного растительного материала). Убедительны данные о включении радиоактивного углерода веществ индивидуальной природы (глюкозы, целлюлозы, гемицеллюлозы, белков, лигнина) в ароматические структуры гумусовых веществ почвы.

В связи с выяснением роли микроорганизмов в синтезе гумусовых веществ особое внимание привлекают темноокрашенные микробные пигменты типа меланинов — полимеров фенольной природы. Это сложные образования, формирующиеся в клетках различных микроорганизмов, например гифах и репродуктивных органах грибов и актиномицетов. Они прочно связаны с белковыми компонентами клетки. Исследования гуминовых кислот почвы и меланинов развивались параллельно. Лишь после накопления достаточного количества экспериментальных данных было установлено, что между этими двумя группами соединений существует сходство. Оно проявляется в способности извлекаться из субстрата щелочами и осаждаться кислотами, не растворяться ни в одном органическом растворителе, в наличии ароматической структуры, функциональных групп, аминокислотном составе, характерном для гумусовых кислот. Новообразованные гумусовые вещества способны к обменным реакциям и активны в образовании почвенной структуры. Выявлено сходство спектров поглощения меланинов и гуминовых кислот в ультрафиолетовой и видимой области, а также в элементном составе.

Меланины представляют собой черные и коричневые высокополимерные соединения, образующиеся при ферментативном окислении фенолов или индолов (пирокатехина, тирозина, диоксииндола) с последующей полимеризацией продуктов окисления.

Темноцветные гифомицеты, относящиеся к родам Cladosporium, Alternaria, Stemphylium, Mycogone, Aureobasidium, в процессе жизнедеятельности образуют внутриклеточные темноокрашенные пигменты сложной ароматической природы, прочно связанные с белковыми компонентами клетки. Содержание меланиновых пигментов в мицелии темноцветных грибов составляет 2—3% на сухую биомассу, количество меланинов, поступающих с мицелием в почву, может достигать значительных размеров, что дает основание прийти к выводу о существенном вкладе грибного меланиногенеза в процесс гумусообразования.

Темноокрашенные актиномицеты распространены в почвах всех типов, преобладая в южных зонах. По данным Г. М. Зеновой, элементный состав, электронные спектры, содержание аминокислот в гидролизатах меланиновых пигментов актиномицетов близки гуминовым кислотам, однако пигментные комплексы из спор вегетативного мицелия Act. umbreferus, Act. brunneus различны. Исследования Е. И. Андреюк, С. А. Гордкенко показали, что спектральные характеристики, кривые потенциометрического титрования, реакционные свойства функциональных групп пигментных комплексов актиномицетов групп Chromogenes, Niger приближаются к таковым низкомолекулярных фракций гумусовых кислот. Авторы считают, что высокая численность хромогенных групп актиномицетов может служить индикаторным показателем синтетических процессов гумуса почв.

Следовательно, не отрицая роли лигнина и его структурных единиц в образовании гумуса, многие микробиологи пришли к выводу о возможности микробного синтеза сложных полимерных соединений типа гуминовых кислот из более простых соединений прямого ряда. Эти вновь образованные структуры способны служить основой для синтеза специфических гумусовых веществ.

Установлено, что в старопахотной торфяной почве содержится больше гуминовых кислот, чем в целинной. С. Г. Скоропанов, Н. Н. Бамбалов с соавт., изучая минерализацию органических веществ окультуренных торфяных почв в условиях Белоруссии, пришли к выводу о неравномерной минерализации их компонентов, хотя в итоге все фракции органического вещества подвергаются минерализации. В начале сельскохозяйственного использования торфа на первых этапах гумификации новообразование гуминовых веществ превалирует над минерализацией, затем их синтез замедляется, и общее количество гумусовых веществ убывает.

По мнению авторов, причину разной скорости минерализации органических веществ следует искать в различиях их химического состава, обогащении органического вещества структурными единицами циклического строения, более устойчивыми к разложению. Немаловажное значение исследователи придают содержанию зольных элементов, которые в процессах минерализации и гумификации выполняют функцию катализаторов. Ю. М. Плоткина отмечает, что количество гуминовых кислот в торфе зависит от степени его разложения. Если мелиорации подвергается торф низкой степени разложения, содержание гуминовых кислот возрастает в результате усиления гумификации в процессе освоения торфяных почв. Десять лет освоения осоково-гипнового торфа Полесской опытной мелиоративной станции, представляющего слабо гумусированную массу со степенью разложения 10% и содержанием углеводов до 50%, привели к увеличению количества гумииовых кислот на 8%. При этом значительно возросла зольность торфа и гуминовых кислот.

Длительное интенсивное сельскохозяйственное освоение старопахотных торфяных почв приводит к уменьшению общего содержания гуминовых кислот, что может быть вызвано усилением процессов минерализации вследствие интенсивного осушения, а также перемещением гумусовых веществ по профилю почвенных горизонтов.

Изменение количественного содержания гуминовых кислот не дает полного представления о процессе их трансформации в торфяной почве. О глубине и направленности процесса минерализации торфа можно судить по изменению соотношения отдельных фракций гуминовых кислот, которые предлагается выделять «мягким» методом. Он заключается в извлечении двух фракций гуминовой кислоты: первой — чередующимися обработками 0,1 М пирофосфата натрия с pH 7 и водой без нагревания (выделенная таким образом фракция представлена собственно гуминовыми кислотами, поскольку она более ароматизирована, содержит меньшее количество боковых цепей); второй — 0,25%-ным NaOH без применения щелочи более высокой концентрации. Осаждение гуминовых кислот предлагается проводить при pH 1. Вторая фракция характеризуется низкой величиной оптической плотности, более высоким содержанием гидролизуемых веществ и относится к промежуточным продуктам гумификации. Каждая фракция объединяет гуминовые кислоты однородного состава и отличается комплексом свойств, определяющих стадию «химической зрелости» выделяемых веществ. Соотношение указанных фракций свидетельствует о направленности и глубине процессов гумификации и минерализации органического вещества торфяных почв.

В торфяных почвах разного ботанического состава доминируют разные фракции гуминовых кислот. В тростниковом торфе преобладают гуминовые кислоты более ароматизированной пирофосфатной фракции, в осоковом — менее ароматизированной, обогащенной алифатическими боковыми цепями. В связи с различиями в химическом составе и свойствах различных фракций гуминовых кислот торфа представлялось необходимым определить степень их устойчивости к воздействию микроорганизмов, играющих важную роль в минерализации органического вещества почвы.

Мы попытались изучить состав и деятельность микроорганизмов, участвующих в биологической трансформации гумусовых веществ торфа, и получить данные о их деятельности в мелиорированных торфяных почвах. В процессе исследований обратили внимание на выявление гумусоразрушающей способности ассоциативных культур и отдельных представителей микроорганизмов торфяных почв.

Исследовали способность представителей разных таксономических групп микроорганизмов — бактерий, низших грибов, актиномицетов, естественных и искусственных микробных ассоциаций использовать фракции гуминовых кислот в качестве источников питания.

Опыты проводили с культурами, выделенными из торфяных почв Белорусской ССР, которые исследовали на способность роста на песке и агаровых пластинах, пропитанных гуматами. Идентификация этих микроорганизмов позволила 22 штамма отнести к родам Mycobacterium и Nocardia, 19 — к грамотрицательным бактериям, 4 — к роду Bacillus, 6 — к классу несовершенных грибов, 4 — к семейству Actinomyceiaceae. Культивирование их на пластинах с гуматами дало возможность отобрать наиболее активные штаммы — Mycobacterium sp. 5, Nocardia sp. 46, Nocardia globerula 66, Flavobacterium sp. 65, Pseudomonas sp. 70; неидентифицированные штаммы — 51 (предположительно Nocardia opacum), 61, 101, 112, 113, 115, а также штаммы грибов и актиномицетов — Penicillium (3 штамма), Trichoderma (2 штамма), Act. griseus, Act. albus, Act. globisporus.

Изучали участие ассоциаций почвенных микроорганизмов и представителей отдельных таксономических групп в процессе трансформации фракций гуминовой кислоты торфяных почв. Работу проводили в условиях лабораторных опытов на специфических жидких средах с добавлением пирофосфатной и щелочной фракций гуминовой кислоты. Необходимые для работы фракции выделили из окультуренных торфяных почв Минской и Полесской опытных мелиоративных станций.

Способность почвенной микрофлоры использовать гуминовые кислоты в качестве источника питания определяли в жидких питательных средах на основе минеральной среды Виноградского, в которую вносили пирофосфатную и щелочную фракции гуминовых кислот. Гуматы брали из расчета 250 мг на 1 л среды (0,025%), pH среды доводили до 7,2. Среды разливали по 50 мл в колбы объемом 300 мл, инокулировали почвенной суспензией (1 мл из разведения 1 : 100) или накопительными культурами, выделенными из торфяных почв.

Для стимулирования деятельности микроорганизмов наряду с вариантами, где гуматы были единственными источниками углерода и азота, были поставлены опыты с внесением стартовых доз углерода (1% глюкозы) и азота (0,005% азотнокислого калия). При культивировании коринеподобных микроорганизмов в жидкую питательную среду вносили насыщенный углеводород (1% гексадекана).

Культивирование проводили в колбах на качалках при 220 об/мин. В его процессе контролировали pH и объем среды. После культивирования биомассу микроорганизмов отделяли центрифугированием и фильтрованием, неоднократно промывали щелочью и дистиллированной водой для снятия гуматов в случае адсорбции. Гуминовые кислоты переосаждали соляной кислотой при pH 1, фильтровали, промывали дистиллированной водой, высушивали при 50—60 °С в сушильном шкафу, затем в вакуумном эксикаторе с пятиокисью фосфора, растирали в ступке, хранили в эксикаторе.

Фракции гуминовых кислот выделяли по схеме Н. Н. Бамбалова из окультуренного торфа, предварительно обработанного хлороформом для экстракции битумоидов. Первая (пирофосфатная) фракция выделялась переменной экстракцией 0,1 М Na4P207 и водой (четыре экстракции по 16—20 ч без нагревания). Вторая (щелочная) фракция — экстракцией 0,1 н. NaOH (четыре экстракции по 16—20 ч без нагревания). Гуминовые кислоты переосаждали соляной кислотой при pH 1, центрифугировали, вымораживали воду; после размораживания гуминовые кислоты промывали, высушивали в термостате при температуре 50—60°, а затем в вакуумном эксикаторе с пятиокисью фосфора.

В нативных и деградированных препаратах фракций гуминовых кислот определяли элементный состав, электронные и молекулярные спектры поглощения. Электронные спектры поглощения определяли на «Specord UV/Vis в ультрафиолетовой и видимой области спектра от 200 до 750 нм. Для сравнительной характеристики использовали е-величины, выражающие оптическую плотность растворов гуматов с определенной процентной концентрацией при длине волны 465 нм, которые определяли на «Spectromom — 204»].

Инфракрасные, или молекулярные, спектры поглощения гуминовых кислот торфа изучали в интервале 800—4000 см-1. В этой области спектра отчетливо проявляются полосы поглощения, обусловленные присутствием в молекулах гуминовых кислот определенных атомных группировок. Водные и щелочные растворы гуминовых кислот оказываются непригодными, так как вода в сильной степени поглощает ИК-излучение и, кроме того, оказывает растворяющее действие на материал, из которого изготовлены кюветы. В то же время органические растворители, используемые в ИК-спектрометрии, непригодны, поскольку в них не растворяются специфические гумусовые вещества. Поэтому для анализа ИК-спектров использовали метод запрессовки препаратов в солевые пластинки— KBr-техника. Применяя этот метод, использовали модификацию Е. А. Юркевич. Гуминовые кислоты тщательно измельчали в агатовой ступке, сушили при температуре 60—70 °С до постоянной массы. 1 г кристаллического бромистого калия особой чистоты, предварительно переплавленного при температуре 900—1000°, высушенного в течение 20—25 ч при температуре 150 °С, перемешивали в нагретом состоянии с 4 мг гуминовой кислоты (концентрация в таблетке 0,4%) в определенной последовательности. Полученную смесь помещали в прессформу. Прессовали после 3-минутной откачки воздуха из прессформы с помощью вакуумного насоса под давлением 7000 кг/см2. Полученные таблетки помещали в эксикатор с пятиокисью фосфора. Для каждой серии исследуемых образцов приготавливали таблетки из чистого KBr, помещали их в канал сравнения. Запись спектра проводили автоматически на двухлучевом инфракрасном спектрометре UR-20.

Определение элементного состава важно при идентификации органических веществ для обоснованного отнесения природных органических соединений различного происхождения к группе гумусовых кислот, а также для изучения изменений, происходящих в веществе. Количественный элементный анализ гуминовых кислот проводили на CHN-анализаторе, содержание С, Н, N, О выражали в процентах по массе на сухое вещество или в процентах по массе на органическое вещество гуминовых кислот. Последнее сделано лишь в исходных препаратах гуминовых кислот, где было возможным определение зольности. Исследовали свойства нативных препаратов фракций гуминовых кислот и их изменение под влиянием ассоциативных, чистых и накопительных 4 культур микроорганизмов.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: