Характеристика протеиназы покоящегося пшеничного зерна и продуктов помола была в значительной степени второстепенным вопросом полемики по поводу теории Иоргенсена, которая заключается в том, что сульфгидрильные соединения оказывают вредное воздействие на тесто, активируя этот фермент в муке. Протеиназная активность муки низка, и фермент из нее не был выделен в высокоочищенном виде.
Боллс и Хейл установили, что протеолитическая активность зародыша, муки из цельного зерна, пшеничного солода и белой муки, определенная путем автолиза, увеличивается в присутствии цистеина или глютатиона. Аналогично этому цистеин увеличивал скорость гидролиза казеина протеиназой в неочищенном экстракте из отрубей. Затем этот фермент концентрировали путем экстракции отрубей разбавленным сернокислым аммонием, осаждением фермента сульфатом аммония между 40 и 80% насыщения и последующим диализом или осаждением ацетоном. Фермент обнаруживал низкую активность, если не подвергался обработке цистеином, цианидом или сероводородом перед испытанием активности (вискозиметрический анализ с желатином в качестве субстрата, рН 5, температура 35,5°). Настаивание фермента в присутствии 4 мг цистеина (в общем объеме 5 мл) с 2 мг персульфата, 1 мг бромата или 2 мг метаванадата ингибировало его полностью. Йодуксусная кислота в концентрации 0,01 М ингибировала фермент на 70%.
Протеиназа муки патент, подверженная десятикратной очистке путем экстракции раствором хлористого натрия и осаждением сульфатом аммония при насыщении между 40 и 80% с последующим диализом против глицерина, оказалась подобной протеиназе из отрубей. Она активировалась цистеином и ингибировалась броматом, персульфатом, метаванадатом, йодуксусной и аскорбиновой кислотами. Оба фермента необратимо инактивировались при разбавлении водой; добавление цистеина перед разбавлением оказывало предохраняющее действие.
На основании полученных результатов эти авторы считают, что улучшающее действие окислителей на тесто можно объяснить их действием в качестве ингибиторов протеиназы муки. Однако Хоу и Глик показали, что добавление бромата к реакционной смеси, содержащей муку стрейт, не оказывает влияния на протеолитическую активность муки при действии как на собственные белки, так и на казеин (рН 5,время реакции от 6 до 24 часов). Количество используемо го, бромата в этих опытах составляло от 0,001 до 0,010% веса муки и соответствовало количествам, применяемым при хлебопечении. Кроме того, вредное воздействие вытяжки из пшеничных зародышей на тесто из муки патент, как это показано с помощью фаринограмм, имело место даже тогда, когда протеаза этого экстракта инактивировалась нагреванием или ингибировалась гексилрезорцином или фторидом.
Хайте, Сандстедт и Шаумбург отмечают, что добавление глютатиона к суспензии из натуральной муки или из муки с гемоглобином не оказывало влияния на количество небелкового азота, образующегося в результате действия мучной протеазы, и в связи с этим полагают, что протеаза муки не относится к ферментам папаинового типа. Этот фермент не ингибировался хлоритом натрия, и при его действии на гемоглобин образовывалось в 6 раз больше небелкового азота, чем при действии на муку.
Расхождения между данными Боллса и Хейла и данными Хоу и Глик а, а также Сандстедтаи Шаумбурга можно объяснить разницей в концентрациях использованных ими окислителей и восстановителей. Хайте, Сандстедт и Шаумбург не обнаруживали никакой активации мучной протеазы при концентрации глютатиона, равной 0,003% (вес на объем). В пересчете на молекулярный вес концентрация цистеина, использованная Xейлом, оказывалась в 150 раз большей. Аналогичным образом Хоу и Глик не наблюдали никакого ингибирования с броматом, взятым в концентрации 0,2 мг на 35 мл реакционной смеси. Xейл показал, что окислители оказывают воздействие только при концентрации от 1 до 2 мг на 5 мл. Таким образом, хотя протеазы муки могут активироваться восстановителями и ингибироваться окислителями, очень маловероятно, чтобы данные ферменты испытывали подавление этими соединениями в тесте, поскольку в практике используются весьма низкие концентрации этих веществ.
Клейковина, отмытая водой из муки, содержит протеиназу, которая не удаляется при таком отмывании водой, а также разбавленным раствором хлористого натрия или уксусной кислоты. Этот фермент действует на клейковину, диспергированную в уксусной кислоте (при концентрации последней 0,01—0,1 н.) и имеет оптимум рН при величине от 3 до 4. Он инактивируется нагреванием (при 100° в течение 10 минут), обратимо инактивируется салицилатом и на 20% активируется тиогликолем. Его оптимальная температура для гидролиза клейковины при рН 3,2 равна примерно 45 (время реакции 63 часа). Оптимальная температура для папаина при тех же условиях равна приблизительно 75°. Указанные ферменты различаются также температурами инактивации (денатурации): клейковинная протеиназа инактивируется после 10-минутного прогревания при 70°, а для инактивации папаина требовалось нагревание до 90°.
Были установлены и другие различия между протеазами муки и папаином. В частности, водные вытяжки муки (85%-ная патент, клир первого и второго сорта) ингибируют действие папаина как на белки муки, так и на гемоглобин, но не оказывают влияния на мучную протеазу. Этот ингибитор является недиализуемым веществом и устойчив к лиофилизации и нагреванию при 80° (в течение 3 минут при рН 5).
Протеолитические ферменты проросшей пшеницы исследованы Маунфилдом. Ферменты извлекали водой из семян, которые предварительно проращивали в течение 5 дней и затем измельчали; с эдестином в качестве субстрата протеиназа обнаруживала оптимум рН при значении 4,1, с желатином — при 5,1, а с пшеничной клейковиной — при 6 (при температуре 40е и продолжительности реакции, равной 4 часам). Фермент не действовал на яичный альбумин и только в незначительной степени действовал на глютенин и глиадин (последний, возможно, был несколько видоизменен при выделении). Цианид в пределах концентраций от 0,0005 до 0,1 М почти удваивал скорость гидролиза эдестина и сдвигал оптимум рН от 4,1 до 4,8. В присутствии клейковины как субстрата фермент не обнаруживал активности. Эти же экстракты содержали и дипептидазу, которая катализировала гидролиз лейцилглицина и глицилглицина. Оптимальные значения рН для этих субстратов в опытах Маунфилда были равны соответственно 7,3 и 7,9. Дипептидаза активировалась цианидом, но в значительно меньшей степени, чем протеиназа. Как показали исследования Гильдебранда и Гильдебранда и Баркерта, протеолитическая активность муки из осоложенной пшеницы может в 3—20 раз превышать протеолитическую активность муки патент. При добавлении к автолизату из такой муки дрожжей увеличивалось образование небелкового азота. Миллер и Джонсон установили, что протеаза из муки осоложенной пшеницы довольно устойчива при рН 3,6, причем ее активность при 20-часовой экспозиции при 5° снижается примерно на 20%, а после 30-минутной экспозиции при 50° — на 21—35%. Полная инактивация наблюдается после 30-минутной экспозиции при рН 9,5—10 и температуре 50—60°. Действие фермента на клейковину, по данным этих авторов, на 45% подавлялось при добавлении йодата калия (от 1 до 100 мг на 20 г субстрата). Однако после того как ферментный препарат был частично инактивирован выдерживанием при рН 3,6, йодат уже не оказывал на него влияния. Этот факт позволяет предполагать, что первоначально в данном препарате могли присутствовать по крайней мере две протеазы.
Оптимум рН для муки из осоложенной пшеницы и для двух препаратов протеиназ, выделенных из Aspergillus oryzae, в случае с клейковиной и гемоглобином, взятыми в качестве субстратов, равен 3—4, с казеином — 5,5—6, с желатином — 7. Кроме того, мука из осоложенной пшеницы имеет сходство с грибными ферментными препаратами в том отношении, что она не обладает ни активностью пепсина, ни активностью, подобной карбоксипептидазной. В муке из осоложенной пшеницы обнаружена активность дипептидазы, осуществляющей гидролиз глицил-тирозина, L- лейцилглицина и бензоиларгинина, тогда как протеаза грибного происхождения действует только на два последних субстрата.