Факультет

Студентам

Посетителям

Световая микроскопия

Для энтомопатогенных вирусов микроскопический анализ материала является одним из основных методов диагностики.

Способ приготовления нативных препаратов для идентификации инклюзионных вирусов зависит от типа заболевания. При анализах личинок насекомых на выявление ядерных полиэдров чешуекрылых рода Borrelinavirus, гранул рода Bergoldiavirus и ромбических включений вирусов рода Vagoiavirus исследуют жировое тело, поражаемое в первую очередь. Для этого личинку препарируют и из разных участков тела вырезают небольшие кусочки жировой ткани, которые помещают в каплю глицерина с физиологическим раствором и покрывают покровным стеклом. Приготовленный препарат можно хранить на холоде несколько месяцев, если края покровного стекла залить воском или парафином.

При ядерных полиэдрах в жировом теле выявляются методом фазового контраста сильно гипертрофированные клеточные ядра, содержащие массу овальных преломляющих свет включений. При гранулезах в нативных препаратах жирового тела можно обнаружить гепертрофию и дезинтеграцию ядра. Отдельные гранулы просматриваются лишь в фазовом контрасте или методом темного поля при максимальном увеличении микроскопа. Ромбические включения рода Vagoiavirus (Poxvirus) выявляются в цитоплазме жировых клеток при просмотре препаратов в фазовом контрасте.

В случае ядерных полиэдрозов перепончатокрылых рода Birdiavirus и цитоплазматических полиэдрозов чешуекрылых рода Smithiavirus препараты готовят из среднего кишечника. Препарированную кишечную трубку разрезают продольно по всей длине, распластывают на предметном стекле в капле глицерина с физиологическим раствором и закрывают покровным стеклом. Приготовленные временные нативные препараты исследуют под микроскопом. В фазовом контрасте в эпителии средней кишки ложногусениц, больных ядерным полиэдрозом, при малом увеличении (объектив 10х) обнаруживается характерная крапчатость, обусловленная гипертрофированными ядрами; при больших увеличениях (ФК объектив водной иммерсии 70х) — полиэдренные тельца.

Идентификация вирусов рода Smithiavirus облегчается их локализацией в цитоплазме цилиндрических и бокаловидных клеток эпителия среднего кишечника. Ядро сохраняет морфологическую целостность до самых последних этапов инфекционного процесса. Анализы личинок насекомых в острой фазе заболевания, проведенные вышеизложенным способом, позволяют с уверенностью идентифицировать вирусы из родов Borrelinavirus, Birdiavirus и Smithiavirus в силу специфики их тканевого тропизма. При использовании сухого патологического материала кусочки из средней части трупа растирают с небольшим количеством воды и готовят взвеси, которые исследуют в раздавленной капле или готовят мазки для последующего окрашивания.

Наиболее трудоемки анализы яиц насекомых. Препараты для микроскопических исследований готовят различными способами. Наиболее простой — раздавливание яиц непосредственно на предметном стекле и приготовление раздавленной капли или мазков. Однако поскольку вирусных включений в яйцах небольшое количество и они значительно меньше полиэдров, развивающихся в личинках насекомых, их концентрируют. Для этого из определенной навески яиц готовят гомогенат в 10-кратном объеме воды, фильтруют через 2—3 слоя марли и центрифугируют до полного просветления жидкости. Осадок ресуспендируют и вновь центрифугируют. Операцию повторяют 3— 4 раза. Из центрифугата готовят мазки для последующего окрашивания.

Препараты, приготовленные способом раздавленной капли, и неокрашенные мазки просматривают в фазовом контрасте или методом темного поля. Эффект позитивного и негативного контраста дает в равной мере четкие результаты. В темном поле ядерные и цитоплазматические полиэдры просматриваются как ярко освещенные капли воды на несмачивающейся поверхности. В препаратах, содержащих большое количество посторонних примесей, они выявляются по форме и более интенсивному преломлению света. Гранулы в темном поле выглядят светящимися точками. Ф. Верд отмечает, что гранулы размером 0,5х0,15 мк даже на окрашенных препаратах не могут быть обнаружены под обычным микроскопом, но видны в темном поле.

При анализах сухого патологического материала и тканевых детритов методом раздавленной капли вирусные включения схожи с некоторыми продуктами клеточного и тканевого метаболизма. У перепончато — и чешуекрылых насекомых в фазах предкуколки и куколки обнаруживается масса протеиновых телец, морфологически трудно отличимых от полиэдренных включений вирусного происхождения. Подобные образования имеются и в просвете кишечника взрослых насекомых. Для анализа такого материала необходимо применение специальных методов окраски. В значительно меньшем количестве в мазках могут присутствовать сферические кристаллы мочевой кислоты и различных уратов. Из других образований, осложняющих диагностику вирусных болезней насекомых, необходимо указать на ромбические кристаллы меланина, которые иногда формируются в большом количестве в цитоплазме некоторых клеток.

Вирусные включения, характерные для родов Borrelinavirus, Birdiavirus и Vagoiavirus, не прокрашиваются обычными гистологическими красителями. Для их удовлетворительного выявления препараты обычно предварительно обрабатывают слабыми растворами щелочей и кислот. После воздействия 1%-ной щелочи или кислоты ядерные полиэдры интенсивно воспринимают многие гистологические красители: гематоксилин, эозин, фуксин, генцианвиолет, метиленовую синь и др. На этом свойстве телец-включений основана большая часть методов их выявления. Одним из наиболее простых и эффективных является метод О. А. Шведовой.

Высушенный на воздухе препарат фиксируют в течение 10—20 мин смесью спирта с формалином (90 мл 70%-ного спирта и 10 мл 40%-ного формалина). Затем мазок просушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают в течение 1 мин 1%-ным раствором едкого натра. После промывания, препарат 3—5 мин окрашивают 5%-ным водным раствором эозина. При этом способе полиэдры окрашиваются в розовый цвет, а общий фон препарата остается светлым.

Дифференцированная окраска ядерных полиэдров достигается методом Похила. Препарат фиксируют на пламени и красят 10—15 сек 1%-ной бриллиантовой или малахитовой зеленью. Краска смывается водопроводной водой. Дополнительно окрашивают 1%-ным раствором пикриновой кислоты. После промывания препарат просматривают под микроскопом. Полиэдры окрашиваются пикриновой кислотой в желтый цвет, общий фон препарата зеленый.

Удовлетворительно полиэдренные тельца выявляются триацидом Эрлиха. В состав красителя входят насыщенные водные растворы оранжа (14—15 мл), кислого фуксина (6—7 мл) и метиленовой зелени (12,5 мл); к смеси добавляют дистиллированную воду (15 мл), 95%-ный спирт (25 мл) и глицерин (10 мл). Применяют триацид в разбавленном виде: 2 мл триацида Эрлиха и 50 мл воды, подкисленной соляной кислотой. Краситель смешивают с исследуемым материалом на предметном стекле и нагревают до появления пузырьков. Тельца включения окрашиваются в ярко-красный цвет.

В. П. Лукьянчиков для диагностики ядерного полиэдроза предложил следующий метод. Высушенный на воздухе мазок фиксируют в течение 10 мин в метиловом спирте, затем вновь просушивают на воздухе и окрашивают по Гимза-Романовскому 3 мин азур-эозином, разбавленным 0,25 объемом дистиллированной воды. После окрашивания мазок промывают водой, сушат и исследуют при среднем и максимальном увеличениях обычного светового микроскопа. Если в препарате содержится микрофлора, то в поле зрения микроскопа обнаруживаются окрашенные клетки микробов, а полиэдренные тельца остаются неокрашенными, четко выделяясь на фоне мазка.

При идентификации вирусов рода Birdiavirus, вызывающих кишечные полиэдрозы у пилильщиков, используют некоторые анатомические особенности насекомых-хозяев. У коконированных фаз и имаго пилильщиков в полости тела могут присутствовать темные плотные образования — цисты, или псевдоопухоли. Наиболее часто подобные образования встречаются у насекомых, переживших вирусное заболевание. Выявляют их путем непосредственного анатомирования насекомых или просвечиванием имаго, предварительно просветленных кипячением в едком калии. Псевдоопухоли обычно состоят из компактных масс эпителиальных тканей кишечника, которые не подверглись гистолизу. В них при специальных методах приготовления препаратов можно обнаружить бактерии и вирусы. Для получения препаратов применяют метод В. А. Смирнова.

Псевдоопухоли раздавливают на предметном стекле, нагревают до 400—600° С и наливают несколько капель раствора насыщенной пикриновой кислоты и воды (1:4). После закипания раствора кислоты добавляют раствор черноголубого нафтола и препарат нагревают до полного испарения. Остывший препарат промывают проточной водой, окрашивают 30%-ным карболовым фуксином Циля в течение 20 с, после чего вновь промывают. Полиэдренные тельца окрашиваются в темно-голубой цвет, бактерии — в розовато-красный.

Цитоплазматические полиэдры рода Smithiavirus окрашиваются насыщенным водным раствором метиленовой сини по Гимза-Романовскому без предварительной обработки щелочами и кислотами. Мазки фиксируют на пламени, спирт-формалином и окрашивают в течение 1 ч. Свойство цитополиэдров окрашиваться без воздействия щелочей и кислот используют для дифференцированной диагностики их от ядерных полиэдров. Однако следует иметь в виду, что свойства вирусных включений с возрастом меняются, и они теряют способность к окрашиванию.

Ромбоидальные кристаллы, характерные для вирусов рода Vagoiavirus, в начальный период формирования, когда их длина не превышает 0,7—1 мк, окрашивают анилиновыми красителями. Созревшие вирусные включения становятся устойчивыми к окрашиванию, но предварительно необходимо их обработать соляной кислотой или щелочью. Ход окраски созревших включений следующий. Препарат держат в течение нескольких секунд при 100° С, затем обрабатывают 3—10 мин 1%-ной соляной кислотой или 2%-ной щелочью и окрашивают по Гимза-Романовскому.

При окраске гранул вирусов рода Bergoldiavirus лучшие результаты дает метод О. И. Швецовой. Мазок фиксируют смесью спирта с формалином в течение 10 мин. После удаления фиксатора препарат обрабатывают 1 мин 1%-ной щелочью, промывают, высушивают и красят карболовым фуксином

в течение 1 мин. После окраски препарат тщательно промывают. При данном способе мелкие формы бактерий окрашиваются аналогично гранулам. Для дифференцирования вируса параллельно окрашивают 2-й препарат, но исключают обработку щелочью. При этом гранулы не воспринимают краситель и не просматриваются при микроскопии.

Для установления тканевой и клеточной локализации вирусных включений готовят срезы насекомых обычными гистологическими методами. Некоторые особенности имеет техника приготовления срезов из яиц насекомых, предложенная Е. Т. Дикасовой. Яйца, несколько уплотнившиеся естественным подсыханием, фиксируют путем суточного выдерживания в фиксаторе Петрункевича при комнатной температуре. Затем материал переносят в дважды сменяемый спирт (70%). В первом спирте рекомендуется примесь иода для удаления сулемы. После выдерживания в спирте содержимое яиц съеживается и отделяется от скорлупы; его переносят на 30 мин в дважды сменяемый абсолютный спирт. В дальнейшем объект выдерживают 1—1,5 ч в дважды сменяемом бензоле, после чего яйца заливают в парафин, минуя этапы пропитывания. При указанном способе заливки не требуется извлечения парафина. Полученные срезы наклеивают на предметное стекло.

В литературе известно большое количество методов окрашивания полиэдренных телец в срезах тканей. Большинство авторов пользуется при исследованиях железным гематоксилином по Гейденгайну. Усовершенствовал указанный метод Р. Лангенбух. Окрашивать железным гематоксилином можно после любой фиксации. Срезы, если это необходимо, доводят до воды, после чего погружают на 1 мин в 96%-ную ледяную уксусную кислоту. Промытые дистиллированной водой срезы протравливают в 2,5%-ном растворе железоаммиачных квасцов в течение 1 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы в течение 1 ч окрашивают раствором гематоксилина (одна часть основного раствора с тремя частями воды), вновь тщательно промывают и дифференцируют в железных квасцах до желаемой степени окрашивания. Полиэдры окрашиваются от темно-голубых до темных тонов.

Способ дифференцированной окраски ядерных полиэдров предложен С. М. Гершензоном. Доведенные до воды срезы помещают на 1,5 мин в 1%-ный водный раствор едкого натра, ополаскивают водой и красят 2— 4 мин пикрофуксином (по Ван Гизону). После ополаскивания в воде и проведения через спирты их дифференцируют в карбол-ксилоле до прекращения отхождения зеленых потеков краски и порозовения срезов. В обработанных таким образом срезах полиэдры окрашиваются в изумрудно-зеленый цвет; ткани насекомого приобретают оранжевые и темно-розовые тона. Кроме полиэдров, в зеленый цвет окрашивается только хитин, но цвет его более темный. Если после окрашивания полиэдры становятся слишком светлыми, увеличивают продолжительность окрашивания синькой Леффлера или уменьшают содержимое карболовой кислоты в карбол-ксилоле; в случае желтоватой окраски тканей насекомого увеличивают содержание кислого фуксина в пикрофуксине.

Цитоплазматические полиэдры рода Smithiavirus и включения рода Vagoiavirus окрашивают по Гейденрайху водным раствором метиленовой сини или по Гимза-Романовскому. Тельца-включения вирусов рода Vagoiavirus, формирующиеся в плазме клеток жирового тела, с возрастом меняют способность воспринимать красители. В незрелой стадии, когда форма их игло — или веретенообразна, они поглощают обычные гистологические красители. С образованием овальных форм включений поглощение краски уменьшается, и они окрашиваются только после обработки жаром, слабой кислотой или щелочью.

При выявлении гранул рода Bergoldiavirus срезы после любой фиксации окрашивают железным гематоксилином (методика аналогична применяемой в случае окраски ядерных полиэдров), затем срезы подкрашивают в течение 2 мин 0,5%-ным эритрозином. После обезвоживания препарат заключают в цедакс. А. Хьюз предложил перед окраской железным гематоксилином по Гейденрайху проводить предварительный гидролиз гистологических срезов в течение 10—30 мин при 60° С. После гидролиза необходимо тщательно отмыть кислоту дистиллированной водой. Окрашенные препараты просматриваются в проходящих лучах обычного светового микроскопа. Для повышения контрастности пользуются цветными светофильтрами.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: