Еще не так давно не было твердой уверенности в том, что переливание замороженных и оттаянных в присутствии глицерина эритроцитов действительно безопасно и может дать положительные результаты.
Когда обработанные глицерином эритроциты вводили в плазму или в физиологический раствор, они быстро гемолизировались. По-видимому, это происходило потому, что молекулы воды проникали в клетки быстрее, чем из них выделялись молекулы глицерина, вследствие чего эритроциты набухали. Указанная трудность была преодолена Словитером, который по предложению Чарлза Харингтона удалял глицерин постепенно путем диализа. Словитер нашел, что небольшие пробы человеческой крови, содержавшие после разбавления 15% глицерина, переживали замораживание при —79° и последующее оттаивание. После удаления глицерина диализом и повторного взвешивания в плазме 80—90% эритроцитов оказывались неповрежденными и, по-видимому, совершенно нормальными. Обработанные глицерином эритроциты кролика, замороженные при —79°, оттаянные и освобожденные от глицерина, метили радиоактивным фосфором (Р32) и вводили в вену донора. Скорость потери радиоактивности клетками циркулирующей крови была почти такой же, как и при введении меченых, но незамороженных эритроцитов.
Еще более широкий размах приобрели опыты, проводимые отделом переливания крови Медицинского научно-исследовательского совета. К 250 мл человеческих эритроцитов добавляли равный объем 0,85-процентного раствора хлористого натрия, содержащего 30% глицерина, и смесь охлаждали до —79°. При вращении контейнера в замораживающей смеси при температуре —79° вся масса застывала приблизительно за 10 мин. Ее выдерживали при этой температуре несколько часов, а затем оттаивали как можно быстрее при +37°. Обработанные Тлицерином эритроциты диализировали при температуре +4° против 0,85-процентного раствора хлористого натрия, содержащего 6% глицерина. Диффузат постепенно разбавлялся, и к концу суток концентрация в нем глицерина составляла менее 0,5%. Диализ продолжали, еще 12 час против 0,85-процентного раствоpa NaCl. После удаления таким путем глицерина эритроциты вновь взвешивали в исходной плазме и пробы воссозданной крови культивировали аэробно и анаэробно, тогда как всю массу инкубировали при +4°. Через 5 дней культуры были стерильными. Замороженные эритроциты, принадлежавшие к группе А типу N, Rh вводили больным с той же группой крови, типом М или MN, Rh—. Больной, страдавший тяжелым хроническим лейкозом получил 100 мл взвеси предварительно замороженных эритроцитов. При этом не наблюдалось никаких неблагоприятных реакций. Испытания по методу дифференциальной агглютинации показали, что число чужеродных эритроцитов в кровеносной системе приблизительно равно числу, которое можно было ожидать, если бы переливали свежую, незамороженную кровь.
После этого провели более точные испытания — вводили большие количества замороженных эритроцитов вместе с таким же количеством незамороженных. Было выбрано трое больных, страдающих железодефицитной анемией. Как незамороженные эритроциты (группа О, тип М) ,так и замороженные (группа А, тип N) хранили перед вливанием в течение примерно 11 дней при Температуре +4°. Замороженные эритроциты, кроме того, обрабатывали глицерином и инкубировали 2—3 час при температуре —79°.
После оттаивания глицерин удаляли, как описано выше. В каждой группе концентрацию переживших клеток группы О (контрольные) и группы А, типа N (замороженные) определяли по агглютинации в последующие за переливанием дни. Общий объем эритроцитов у каждого реципиента вычисляли спустя 24 или 48 час после переливания по методу Рива и Вилла, вводя небольшое количество эритроцитов, меченных Р32. Таким способом можно определить как относительное число замороженных и незамороженных клеток, так и абсолютное число живых эритроцитов. Полученные данные показали, что число выживших замороженных клеток немногим отличается от числа контрольных клеток, а в одном случае первых было больше, чем вторых. Установлено, что из всего количества эритроцитов, замороженных перед переливанием, 76—96% присутствовало в крови спустя 24 час. Словитер показал также, что 70% обработанных глицерином эритроцитов человеческой крови можно восстановить после хранения в течение 6—9 месяцев при температуре —79°. Из эритроцитов, хранившихся от 3 до 8,5 месяцев при —79°, удаляли глицерин и те из них, которые не имели никаких повреждений, использовали для переливания. Затем определяли число переживших эритроцитов в кровотоке и сравнивали с числом выживших свежесобранных эритроцитов разных групп крови, использованных для переливания в то же самое время. Оказалось, что спустя 24 час после переливания число выживших эритроцитов, хранившихся при —79° в течение 3—6 месяцев, составляло 72—92% числа выживших контрольных эритроцитов. После этого и контрольные и замороженные клетки удалялись из кровотока с одинаковой скоростью. Контрольными служили только что собранные эритроциты, тогда как замороженные хранились после оттаивания в течение 11 дней при +4°. Очевидно, что выживаемость эритроцитов, которым удалось избежать лизиса в ходе замораживания при —79°, хранения и оттаивания, а также в процессе удаления глицерина, если и снижалась, то крайне незначительно.
В ранних опытах относительно небольшое число эритроцитов восстанавливалось после хранения при -15° в среде, содержащей глицерин. Так, около 50% клеток восстанавливалось после хранения в течение 29 дней при —15° и только 20% — после пребывания в течение 80 дней при той же температуре. Тем не менее, восстановленные и освобожденные от глицерина клетки после переливания жили в кровяном русле нормальный, положенный им срок. Это показывает, что даже при температуре — 15° скорость старения понижалась. Можно было сделать вывод, что эритроциты, восстановленные после продолжительного хранения в замороженном состоянии, имели после введения их в кровоток нормальную продолжительность жизни. Поскольку какая-то часть клеток разрушалась во время хранения в процессе удаления глицерина, необходимо было уменьшить эти потери, чтобы массовое хранение эритроцитов стало возможным и было использовано при создании банков крови.