Лавлок определял степень гемолиза, наступавшего после оттаивания в пробах эритроцитов, которых замораживали в физиологическом растворе (0,15 М NaCl) на 5 мин при температуре от—3 до —20°.
Кроме того, он готовил взвеси других проб эритроцитов в растворах, содержащих хлористый натрий в таких концентрациях, что они замерзали при этой температуре, и через 5 мин определял степень гемолиза. Оставшиеся клетки он переносил в 0,15 М раствор NaCl и опять определял степень гемолиза. Полученные результаты показывали, что гемолиз, наступивший в результате замораживания при данной температуре и последующего оттаивания, можно было в точности воспроизвести, инкубируя клетки в течение 5 мин при 0° в растворе хлористого натрия, замерзающем при этой температуре, и затем перенося их опять в физиологический раствор.
Когда клетки пребывали в концентрированном растворе хлористого натрия менее 0,5 мин, степень гемолиза понижалась.
Ясно, что концентрированный раствор NaCl вызывает разрушения относительно медленно. Лавлок определял степень гемолиза в пробах эритроцитов, замороженных и согретых с различной скоростью. В клетках, подвергавшихся в течение 1,8 и 5 сек воздействию температур от —3 до —40°, гемолиз был незначительным, тогда как после воздействия в течение 30 сек почти все клетки гемолизировались. Не имело существенного значения, подвергались ли клетки продолжительному воздействию этих критических температур во время замораживания или же во время оттаивания. Степень гемолиза соответственно снижалась, когда эритроциты находились менее 5 сек в растворах с концентрацией NaCl более 0,85 М.
Лавлок подчеркивает, что чувствительность эритроцитов к изменениям ионной силы суспензионной среды весьма велика. При медленном и умеренно быстром охлаждении до температур ниже нуля эритроциты еще до того, как на них мог бы оказать вредное действие процесс замораживания, неизбежно повреждаются в результате повышения концентрации солей. Критическая концентрация солей достигается в то время, когда температура еще слишком высока, чтобы другие возможные факторы могли причинить клеткам вред. Меримэн согласен с Лавлоком в том, что гемолиз, наступающий при охлаждении эритроцитов до очень низких температур и последующем медленном согревании их, обусловлен продолжительным воздействием концентрированных растворов солей во время образования и таяния льда. Ринфрет считает, что отсутствие гемолиза в пробах крови, которые были охлаждены и согреты с максимальной скоростью, зависит, по крайней мере частично, от того, что таким путем удается избежать продолжительного действия концентрированных растворов солей.
Основная причина лизиса эритроцитов заключается в изменении физической и химической структуры их оболочки, богатой липидами и липидно-белковыми комплексами. Лавлок показал, что эритроциты, взвешенные в растворах хлористого натрия при 0°, теряют холестерин и фосфолипиды. При повышении концентрации хлористого натрия от 0,16 до 0,85 М при 0° или же во время частичного замораживания количество выделяющихся из клеток липидов увеличивается. При концентрации хлористого натрия выше 0,85 М по мере усиления выделения липидов соответственно возрастает и выделение фосфолипидов. После пребывания в течение 1 час в 1,03 М растворе NaCl при 0° эритроциты утрачивали 9% холестерина и 26% фосфолипидов. Следовательно, отношение содержания холестерина к содержанию лецитина в клеточной оболочке увеличивалось. Такая избирательная потеря фосфолипидов делает эритроциты проницаемыми для катионов. В результате клетка медленно набухает и в конечном счете разрывается. Или же при возвращении «перегруженных» катионами клеток в физиологический раствор молекулы воды быстро проникают в них, и немедленно наступает лизис. Таковы процессы, протекающие в клетках во время медленного замораживания и оттаивания.
Труднее понять причину гемолиза при чрезвычайно быстром охлаждении эритроцитов. Однако и здесь нет никаких сомнений. И Меримэн, и Люйет считают, что существует оптимальная скорость охлаждения небольших проб эритроцитов до низких температур. При превышении этой скорости часть клеток после оттаивания гемолизируется. Одни исследователи предполагают, что клетки повреждаются в результате образования внутриклеточных кристаллов при превышении критической скорости охлаждения. По мнению других, структурные изменения и повреждения оболочки эритроцитов наступают при слишком быстром охлаждении до температур ниже нуля.
Нормальные эритроциты в физиологической среде не повреждаются при резком охлаждении до температур выше нуля. Наоборот, эритроциты, подвергшиеся воздействию некоторых животных ядов или бактериальных токсинов, склонны к гемолизу при резком охлаждении от температуры тела или комнатной температуры до 0°. Это связано с наличием в токсинах ферментов, гидролизирующих лецитин в оболочках эритроцитов. Лавлок установил, что эритроциты могут стать чувствительными также к резкому охлаждению до температуры выше нуля, если их взвесить в гипертонических солевых растворах с концентрацией NaCl более 0,8 М. В своих опытах он определял потерю клетками липидов и рассчитывал отношение между оставшимися в клетках холестерином и лецитином. Чем выше было отношение содержания холестерина к содержанию лецитина, тем большая доля клеток гемолизировалась после резкого охлаждения от +37 до 0°. Долю гемолизировавшихся клеток можно было сократить, добавив лецитин в среду, в которой клетки были взвешены до охлаждения, и, наоборот, степень гемолиза повышалась при добавлении в среду холестерина. Кроме того, гемолиз усиливался при добавлении в среду а-токсина Clostridium welchii, содержащего лецитниазу.
Согласно одной из существующих теорий, оболочка эритроцита состоит из волокон липопротеида эленина, расположенных параллельно поверхности клетки и скрепленных между собой липидами. Лавлок высказал предположение, что температурный шок при температурах выше нуля обусловлен физическими изменениями, вызываемыми повышением относительного содержания холестерина в цементирующих липидах. Холестерин плавится при 148,5°, тогда как лецитин становится мягким уже при 0°. Таким образом, чем больше отношение содержания холестерина к содержанию лецитина, тем тверже цементирующее вещество при температурах как выше, так и ниже пуля. При очень быстром охлаждении клеток до температур ниже нуля цементирующие липиды испытывали резкое напряжение. Если они затвердевали и становились хрупкими, то могли ломаться. Не исключено, что основной причиной температурного шока при температурах ниже нуля было разное сжатие различных компонентов клеточной стенки. Пока мы не имеем более точных данных о структуре оболочек эритроцитов и других клеток, мы не можем делать никаких окончательных выводов о природе температурного шока при температурах выше и ниже нуля. Результаты, полученные при медленном или быстром охлаждении эритроцитов млекопитающих до очень низких температур, и различные теории, возникшие на их основе, вряд ли могут объяснить чувствительность к холоду у пойкилотермных животных и у растений. Критические замечания по поводу исследований Лавлока исходят из данных, полученных на растениях, и, следовательно, не могут быть убедительными.