Этот способ состоит в посадке в культуру in vitro пыльников на ранних фазах, на которые было оказано прямое воздействие различными факторами или косвенное — через донорное растение. В этих случаях, как мы полагаем, снимается детерминация нормального хода микроспорогенеза и образования пыльцы, в результате чего получается большой процент различных, искусственно вызванных аномалий.
Для получения аномалий из исходно нормальной спорогенной ткани могут быть использованы такие факторы, как среда, температура, биологически активные вещества, магнитные поля, облучение и т. д. Так, воздействие Нелазером или концентрированным импульсным белым светом на одноядерной стадии пыльцы (микроспоры) пшеницы позволило увеличить выход гаплоидов Сходные результаты были получены при воздействии на пыльник некоторых видов растений высокой температурой. Для изменения спорофитной и гаметофитной детерминации возможны следующие варианты воздействия:
1) донорное растение; время воздействия может быть различным: кратковременным — на один этап развития растения (либо выход в трубку, либо стеблевание и т. д.) или длительным (пролонгированным); в значительной степени это зависит от фактора воздействия, а также от вида растения;
2) локальное — на пыльник или соцветие, на изолированный спорогенный комплекс. Независимо от способа воздействия, во всех случаях, вероятно, снимается детерминация нормального хода микроспорогенеза и развития пыльцевого зерна. В результате этого спорогенная ткань, которая в норме (т. е. в естественных условиях) дала бы нормальную фертильную пыльцу (способную к оплодотворению), при воздействии на нее даст аномальные структуры: с равным делением, многоядерные, многоклеточные и т. д.
Можно предположить, что у большинства цветковых растений, в том числе у злаков, оптимальной фазой для искусственного индуцирования аномалий, а значит, и получения наибольшего выхода гаплоидов, является стадия мейоза, а в некоторых случаях и более ранняя стадия в развитии спорогенной ткани.
Современные данные, касающиеся ядерно-клеточных отношений, продолжи-тельности митотического цикла, скорости накопления РНК, активности белок синтезирующей системы и т. д. у разных покрытосеменных, показали, что события, происходящие в мейозе, часто детерминированы еще в премейотической фазе.
Следует отметить, что при воздействии факторов на гибридные формы надо всегда учитывать, что течение мейоза у них происходит с большими аномалиями
Классификация различных типов аномалий заслуживает специального внимания, поскольку характер их развития, вероятно, обусловливает определенный путь морфогенеза, по которому идет дальнейшее образование гаплоидов. В связи с отсутствием детальных исследований по выявлению механизма образования естественных и индуцированных аномалий, а также и их классификаций, в настоящее время трудно сказать, на какую стадию мейоза целесообразнее воздействовать, чтобы получить максимальное количество гаплоидов. Однако для отдельных видов известно, что разные группы генов обусловливают различные формы аномалий. Дальнейшее поведение этих аномалий (многоядерных, многоклеточных и др.) неясно, поэтому остается неопределенным и путь морфогенеза (эмбриоидогенез или гемморизогенез через каллус), т. е. путь воспроизведения гаплоидных растений. Следует подчеркнуть, что эмбриоидогенез несомненно является более прямым и выгодным путем для получения гаплоидов, поскольку он связан не только со сложным многоступенчатым процессом морфогенеза через каллус в случае гемморизогенеза, требующим трудоемкого процесса сред и пересадок, но и с генетически однородным материалом. Однако не исключено, что в дальнейшем для более эффективного получения регенерантов можно будет сочетать оба пути, т. е. из одного пыльцевого зерна или микроспоры сначала получить каллус (каллусогенез), а потом вызвать образование массового количества эмбриоидов.
Наши представления об оптимальной стадии пыльника, воздействуя на которую можно изменить процент выхода гаплоидов, в определенной степени согласуются с некоторыми литературными данными. Например, китайскими учеными было показано, что чем более ранняя стадия развития пыльника берется для посадки в культуру in vitro, тем больше пыльцы с равным делением (т. е. аномальной) образуется в пыльцевом зерне пыльника пшеницы, тем, следовательно, больше получается гаплоидов. При этом частота равного деления пыльцы намного больше, чем в пыльнике in situ. Кроме того, как указывается в литературе, культивирование in vitro пыльников на стадии мейоза вызывает образование аномальных многоядерных клеток, т. е., как мы полагаем, изменение характера течения мейоза. Заслуживает внимания и тот факт, что существует зависимость между стадиями развития пыльника, выходом каллуса и процентом образования зеленых гаплоидов.
Таким образом, используя пыльники цветковых, в частности злаков, на ранних стадиях развития при экспериментальном воздействии (включая посадку пыльников в культуру), исследователь получает растения-гаплоиды, вероятно, из искусственно вызванных аномальных структур.