До сих пор мы говорили о ДНК, о ее строении, о том, как она кодирует наследственные признаки, но не сказали, как устроены хромосомы у бактерий и бактериофагов.
Бурное развитие генетики и цитологии не могло обойти стороной этот вопрос. Как часто бывало и раньше, генетические эксперименты и здесь подчас опережали цитологические. Еще цитологи не умели выделить хромосомы бактерий, еще не могли рассмотреть их в электронном микроскопе, а генетики на основе своих опытов уже создавали представления о том, как построены хромосомы бактерий и фагов.
Эти представления не укладывались в привычные схемы, все изученные раньше хромосомы высших организмов — животных и растений — имели сходное строение: палочковидные структуры, по-разному искривленные, одинаково красящиеся. А в опытах генетиков с бактериями и фагами получалось, что в бактериях хромосомы вовсе не палочки, а замкнутые колечки. Это было и новым и непонятным.
Прежде чем ученые воочию убедились, что хромосомы бактерий и фагов имеют форму кольца, это много раз доказывалось косвенно — и химиками, и физиками, и генетиками. Поэтому, когда появился первый снимок хромосомы, где она действительно лежала, свернувшись в кольцо, никто особенно не обратил на это внимания.
Впервые предположение о том, что хромосомы бактерий и фагов — кольцевые, высказали Жакоб и Вольман. Произошло это следующим образом.
Английский ученый Хейс изучал процессы обмена генетическими признаками у бактерий. Он скрещивал между собой разные бактерии и смотрел, что получается. Были у него, скажем, бактерии, которые могли развиваться в присутствии стрептомицина (их называли устойчивыми к стрептомицину мутантами) и, кроме того, имели еще одну мутацию А+. Хейс решил скрестить их с бактериями, не растущими в присутствии стрептомицина и имеющими мутацию А-.
Оказалось, что от такого скрещивания можно получить клетки, имеющие сразу мутацию А — и устойчивость к стрептомицину. А вот получить клетку с мутацией А+ и чувствительностью к стрептомицину не удалось ни разу. Выходило, что бактерии были как бы разными. Одни из них передавали свои признаки, другие — нет.
Хейс назвал эти бактерии мужскими и женскими. Из своих опытов он сделал и другой важный вывод: существует полярность передачи признаков. Когда половые клетки высших организмов оплодотворяют друг друга, их хромосомы попросту сливаются. У бактерий дело обстоит иначе. Из клетки отца мужская хромосома проникает внутрь женской, и можно по часам отмечать вступление новых и новых генов внутрь материнской клетки. Спустя 10 минут после начала контакта между клетками в женскую клетку входит ген А, спустя 15 минут — Б, еще через пять минут — В и так далее, пока за полтора-два часа все гены от одной клетки не переходят к другой.
Оба предположения Хейса впоследствии подтвердились.
Ученые выделили много женских и мужских линий и напали интенсивно их скрещивать. Тут и получился казус, который нельзя было объяснить иначе, чем предположением, что хромосома бактерий существует в виде кольца.
Чтобы не вдаваться в тонкости генетических терминов и обозначений, предположим, что мы перенумеровали все гены в хромосоме бактерии. Их получилось двадцать. Если бы в клетке была одна хромосома в виде палочки, то признаки бактерий всегда передавались бы следующим образом: сначала первый, затем второй — и так далее, вплоть до двадцатого. Но оказалось, что в разных опытах гены передавались по-разному. Иногда, действительно, вначале шел первый, а за ним другие: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, а иногда передача начиналась откуда-нибудь с середины, например: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, а потом обрывалась.
Когда накопилось много сведений о порядке передач признаков, были получены примерно такие ряды:
1,2, 3, 4, 5, 6,7
9, 10, 11, 12, 13, 14
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
16, 17, 18, 19, 20, 1,2, 3.
Пока этих рядов не накопилось достаточно, у ученых создавалось впечатление, что гены в хромосомах бактерий расположены беспорядочно.
Но когда к этим рядам присмотрелись внимательнее, то увидели важную особенность. Их, действительно, можно было свести в один ряд, если предположить, что хромосома бактерии представляет собой кольцо, которое можно разорвать в любом месте, и поэтому любой из генов может быть передан первым.
Кажется, все понятно. Однако недоуменных вопросов не убавилось. Прежде всего, что значит «можно разорвать кольцо хромосомы в любом месте»? Как разорвать? Что же, каждый раз кольцо рвется, прежде чем осуществляется скрещивание? А в результате чего рвется кольцо?
Наконец, Хейс и Жакоб и Вольман внесли ясность. Они доказали, что кольцо действительно рвется всякий раз перед скрещиванием. Нашли они и что «рвет» хромосому. Оказалось, в мужских клетках есть небольшие частички, которые назвали факторами пола (F-факторами). Обычно факторы пола существуют в клетке отдельно от кольцевой хромосомы. (Кстати, фактор пола и определяет мужскую или женскую природу клетки).
Когда фактор пола присоединяется к хромосоме, она разрывается и фактор пола начинает играть роль толчка. Это напоминает обычную картину на Волге. Плывет длинная-длинная огромная баржа, к корме которой прилип буксир-толкач. Кажется, что такая малютка и не сдвинет с места громадную баржу, но на самом деле толкач как-то незаметно подталкивает ее сзади, и она бодро движется по волжским волнам.
Так и F-фактор, «вцепившись» в конец разорванной хромосомы, «пропихивает» ее в материнскую клетку. Если ничто не успеет оторвать клетки друг от друга (а это чаще всего и происходит), то в клетку матери может проникнуть вся хромосома отца. Если контакт между клетками нарушится, то в клетку матери перейдет лишь небольшой фрагмент хромосомы.
Разными способами и путями ученые подтвердили справедливость предположения, что хромосомы бактерий — кольцевые. А сейчас для целого ряда бактерий известен даже порядок расположения генов в кольцах. Некоторые бактерии, обитающие в пищеварительном тракте, например кишечная палочка и сальмонелла, так похожи, что когда смотришь на их хромосомы, то с первого взгляда не замечаешь разницы — так совпадают в них гены. Лишь кое-где можно заметить небольшие несовпадающие кусочки.
Так на молекулярном уровне стало оправдываться давно высказанное положение, что эволюция шла за счет еле заметных, точечных изменений наследственности. Предположение это было высказано еще Дарвиным, а затем твердо установлено выдающимся советским генетиком профессором Сергеем Сергеевичем Четвериковым в 1926 году.
История открытия кольцевых хромосом у бактериофагов была не менее интересной. Причем, если самое веское слово в пользу кольцевидности хромосом бактерий сказали генетики, то для фагов это слово прозвучало из уст биохимика — американского ученого Синсхаймера. Разными способами он изучал структуру хромосомы мельчайшего из бактериофагов — φХ174. Этот фаг чаще называют кратко «фиксом» (от первых букв фи и икс). Он имеет хромосому в виде одной цепочки ДНК. Помните, когда мы рассказывали о структуре ДНК, то говорили, что она может быть одно — и двухнитевой. У фикса она как раз однонитевая.
Среди ферментов, обнаруженных в клетке, были найдены такие, которые разрушали ДНК. Но каждый из них делал это по-разному: одни рвали ДНК в середине, другие отщепляли нуклеотиды с концов, третьи разделяли полимерную молекулу на одинаковые куски. Когда Синсхаймер попытался оторвать от ДНК фикса нуклеотиды с конца молекулы с помощью соответствующего фермента, у него, к его удивлению, ничего не вышло. С концов хромосомы ничего не отрывалось.
Тогда Синсхаймер решил проверить: а не сидят ли на концах хромосомы какие-нибудь «белковые шапочки», которые попросту не дают этому ферменту подступиться к ДНК. В ход пустили другой фермент, который «съедал» белки, но не трогал ДНК, и попытались после этого начать «кусать» ДНК с концов с помощью первого фермента. Если бы дело было в экранировании нуклеиновой кислоты белком, то теперь, после применения фермента, съедающего белки, ДНК обязательно разрушилась бы. Однако все осталось по-прежнему — фермент, рвущий ДНК с концов, отказывался разрывать ДНК хромосомы фикса. Тогда Синсхаймер применил для изучения хромосом этого фага физические методы. Он попытался посмотреть, как будут вести себя фиксовые хромосомы, если их начать осаждать в ультрацентрифуге. К удивлению ученого, хромосомы вели себя не как палочки, а скорее как колечки.
После этого все прежние неудачи стали понятны. Конечно, дело не в белке и не в чем-либо другом. Просто фермент рвет ДНК с концов, а у ДНК фикса никаких концов нет. Хромосома этого фага кольцевая.
С этого в сущности и начался поток доказательств в пользу того, что у разных фагов хромосомы существуют в форме кольца. В самое последнее время сообщений, что то у одного, то у другого фага обнаружены кольцевые хромосомы, стало появляться все больше. Особенно интересны работы группы исследователей, из Иллинойского университета М. Хайаши, М. Н. Хайаши и С. Спигельмана. Эти авторы подтвердили кольцевидность хромосом фага и сфотографировали их. Кроме того, они подошли вплотную к решению очень важных вопросов: со скольких ниток ДНК, с одной или с двух, читается генетическая информация, и как размножается ДНК — удвоением одной или сразу двух нитей.
Напомним, что по первоначальным гипотезам считалось, будто построение новых нитей ДНК идет следующим образом. Водородные связи, удерживающие вместе две нити ДНК, разрываются, и к свободным концам начинают достраиваться партнеры — к аденину тимин, а гуанину цитозин и т. д. Так как первоначально ДНК была двунитевая, то на разошедшихся двух одиночных нитях и начинается достройка «зеркальных» копий и, в конце концов, образуются две абсолютно одинаковые двойные цепи нуклеиновой кислоты. Точно так же представляли себе и образование информационной РНК. Раз обе нити ДНК могут строить себе копию при размножении, то почему бы им не строить себе подобным образом РНК? Вначале то, что оба процесса идут именно так, не вызывало сомнений. Но когда стали разбираться более тщательно, то безмятежная ясность исчезла. Судите сами. Мы все время исходили из полной равноправности нитей. А так ли это? Допустим, что, записав на одной нити на языке оснований следующую фразу: АТГТААЦАГТЦА, «мы записали какой-нибудь признак (например, цвет волос). Но ведь на второй нити будет записано не то же самое, а ТАЦАТТГТЦАГТ, потому что основания на одной нити точно задают основания на другой, так как правило, что аденин соединится с тимином и только с тимином, а гуанин с цитозином и только с цитозином, должно всегда выполняться. Поэтому, читая фразу в одной нити, мы получим один набор аминокислот (помните, каждой аминокислоте соответствует своя тройка нуклеотидов), а читая вторую нить — совсем другой. И получится, что первая тройка верхней нити даст нам аспарагин, а соответствующая ей тройка в нижней нити — глутаминовую кислоту. Поэтому то, что образуется на первой нити, будет иметь совсем другой смысл, чем то, что даст вторая. Вернее, одна даст осмысленную фразу, а другая — как бы ее зеркальное отображение.
Возник вопрос: что же, в клетке читаются обе нити — и смысловая, и бессмысленная? И если обе, то зачем нужна бессмысленная?
Предположений было высказано уйма. Многие пытались устранить противоречия логическими построениями. Часто рассуждения были на уровне следующих: «Зачем клетке читать бессмысленную нить? Просто бессмысленная нить нужна для структурных целей, она удерживает первую нить от разрывов», — и дальше в том же роде.
Когда Синсхаймер обнаружил, что в фиксе нуклеиновая кислота представлена только одной нитью, вывод напрашивался сам собой: нужна только одна нить. Обходится же фикс одной нитью.
Однако очень скоро опять-таки Синсхаймер нашел, что однонитевая ДНК фикса, входя в клетку, чтобы начать размножаться, прежде всего превращается в так называемую «репликативную форму» — иначе говоря, достраивает себе вторую пить, и лишь после этого начинается размножение ДНК фикса.
Вскоре американский биохимик Берг провел синтез РНК в пробирке и засвидетельствовал: да, обе нити ДНК участвуют в образовании мессенджера. Вроде бы все стало ясным.
Однако процессы внутри клетки могут идти совсем по-другому, чем в пробирке. Как узнать, что происходит в клетке?
На этом этапе исследований снова оказалась очень удобной модель фага фикс. Ведь у зрелого фага только одна нить ДНК. А в клетке, зараженной этим фагом, находятся только двойные нити ДНК этого же фага, их репликативные формы. Если суметь выделить из клетки отдельно репликативные формы фаговой ДНК, информационную РНК фага и после этого суметь сцепить И-РНК с ДНК, то, наверное, все определится? К этому времени был разработан метод так называемой гибридизации нуклеиновых кислот. Две нити, родственные друг к другу, сцеплялись водородными нитями и образовывали двухнитевую структуру. Если же нити не были родственны друг другу, то таких гибридов не образовывалось.
В лаборатории Спигельмана начали изучать синтезы информационной РНК в клетках, зараженных фиксом, затем вынимать эту РНК и пытаться сцепить с однонитчатой и двунитчатой ДНК (с репликативной формой). Были проделаны тончайшие эксперименты.
И в результате оказалось, что фаговая И-РНК похожа только на одну из ниток репликативной формы, причем совсем не на ту, которая пришла из частицы фага, заразившей клетку. Получалось, что синтезировалась эта И-РНК на достроенной в клетке копии исходной молекулы ДНК.
Значит, действительно в клетке происходит одно, а в пробирке другое? Авторы решили определить, в чем разница. Оказалось, что дело в форме, в которой существует ДНК. В опытах Берга были взяты не кольцевые, а линейные молекулы ДНК. Спигельман и Хайаши доказали, что репликативная форма представляет собой кольцо. И пока она не нарушена, не разорвана — синтез будет идти только с одной нити.
Правда, в августе 1964 года американский исследователь Гейдушек и его сотрудники показали, что основную роль играет не столько то, нарушено кольцо или нет, сколько то, как сильно изогнута ДНК.
Но так или иначе, доказательство Спигельмана и Хайши, что характер синтезов копий ДНК зависит не только от последовательности оснований в молекуле, но и от формы самой молекулы, оказалось очень важным. Попутно Спигельман и Хайаши сфотографировали в электронном микроскопе кольцевую репликативную форму ДНК фага и даже взвесили ее на весах и измерили длину ее окружности. Весит кольцо 6,4·106 кислородных единиц или 0,000 000 000 000 000 01 грамму, а длина окружности кольца равна 1,89 микрона. Авторы подсчитали, что в таком кольце сидит 5600 пар оснований. Это хорошо согласовывалось с ранними оценками числа оснований, полученными из длины разорванного кольца; по ним выходило, что в ДНК фага 5500 ,пар оснований.
Мы рассказали о маленьком фаге фиксе, но сегодня уже известно, что и такой большой бактериофаг, как Т4, также имеет кольцевую хромосому. Тот же результат получен и для вирусов животных. Кольцевая хромосома найдена в вирусе поли-омы. Можно ожидать, что скоро список расширится и станет ясно, все ли фаги и вирусы имеют кольцевые хромосомы.