Для получения чистых препаратов пшеничного глиадина существует несколько методов. Основным из них является метод Осборна, принцип которого заключается в извлечении глиадина из пшеничной муки или из предварительно отмытой клейковины с помощью 60—70%-ного этилового спирта. После отгонки растворителя в вакууме при невысокой температуре (35°) выпавший глиадин многократно промывают эфиром и водой, вновь растворяют в 70%-ном спирте и повторяют все эти операции 2—3 раза.
Для окончательной очистки и обезвоживания сырой препарат глиадина выдерживают в течение нескольких дней в этиловом спирте возрастающих концентраций (до абсолютного) и в сухом эфире. Получается сухой тонкий порошок чистого глиадина.
Первоначальный метод Осборна (Osborne, 1907) подвергался впоследствии различным изменениям (Кизель, Новиков и Сухоруков, 1931; Troensegaard, 1931) и некоторые его модификации приобрели известность в качестве отдельных методов. Так, например, по методу Дилла и Алсберга (Dill, Alsberg, 1925) глиадин извлекают из клейковины разбавленным спиртом (60%), раствор сгущают в вакууме и белок очищают, комбинируя высаливание его водными растворами хлоридов натрия и лития, с осаждением из спиртовых растворов при низкой температуре.
Многократная очистка указанными способами завершается переосаждением глиадина абсолютным спиртом и приводит к получению чистых препаратов, хорошо растворимых в 50— 70%-ном этаноле. По методу В. Л. Кретовича (Кретович, 1937; см. также Белозерский и Проскуряков, 1951) глиадин извлекают из сырой клейковины 64—65%-ным спиртом, отгоняют в вакууме (при 35° С) растворитель, тщательно промывают белок ледяной водой, вновь перерастворяют его в спирте и, повторив указанные операции 2—3 раза, осаждают глиадин из спиртового раствора, разбавляя его 10-кратным объемом безводного ацетона. Осадок обезвоживают путем проведения через 96%-ный и абсолютный спирт, серный эфир и окончательно — в вакууме-эксикаторе. Этот метод позволяет получить неороговевшие препараты глиадина, более чистые, чем по Осборну.
Метод Блиша и Сандстедта (Blish, Sandstedt, 1926) основан уже на ином принципе, чем метод Осборна и его модификации. Сырую клейковину сушат в вакууме при температуре 60—65° С, измельчают и обрабатывают 0,07 п уксусной кислотой. В этих условиях в раствор переходит только глиадин, а глютенин остается нерастворенным. К фильтрату добавляют хлористый литий или нейтрализуют его щелочью, причем глиадин выпадает в осадок, который растворяют в 60%-ном спирте и вновь осаждают белок избытком абсолютного спирта, содержащего немного эфира я хлористого лития. Очистку повторяют и после сушки в вакууме получается очень чистый препарат глиадина.
Третий принцип положен в основу получения глиадина методом Кука (Cook, 1931). Сырую клейковину диспергируют в 30%-ном водном растворе мочевины, удаляют крахмал центрифугированием, высаливают глютенин сернокислым магнием (0,12—0,18 от насыщения) и осаждают глиадин путем разбавления дисперсии водой. После обезвоживания спиртом и эфиром получается препарат глиадина, растворимый в 60— 70%-ном спирте (раствор опалесцирует).
Описанные методы получения глиадина и особенно метод Осборна предложены давно, но и в настоящее время они применяются с теми или иными видоизменениями, преследующими главную цель — избежать, по возможности, денатурации белка, в процессе выделения и получить его в состоянии, наиболее близком к нативному. Уменьшение денатурации белка достигается, во-первых, проведением всех операций по его выделению при низких температурах (что резко снижает также скорость ферментативных процессов, изменяющих белок), а во-вторых, отказом от длительного обезвоживания белка органическими растворителями — спиртом, ацетоном, эфиром и др.,— способными значительно денатурировать белок. Вместо этого сушка препаратов проводится лиофильным способом, т. е. влага сублимируется из замороженного белка в вакууме. Преимущества «мягких» режимов выделения белков доказаны многими работами и в настоящее время все исследования белков проводятся при строгом соблюдении условий, предохраняющих их от денатурации. Например, в работе В. Л. Кретовича и сотр. (Кретович, Бундель, Мелик-Саркисян, Степанович, 1954) показано, что альбумины, и глобулины семян гороха, выделенные при низкой температуре и обезвоженные лиофилизацией, обладают ферментативной активностью (каталазной, пироксидазной, инвертазной, дипептидазной и карбоксилазной) в противоположность тем же белкам, но полученным по методу Осборна. и следовательно, в известной степени денатурированным. Несомненно, что и в отношении глиадина изменение обычных методов его выделения с учетом защиты от денатурации приведет к получению препаратов, больше отвечающих нативному состоянию этого белка.
Попытка разработки такой методики была предпринята недавно Е. И. Медведевой (1958, 1960а, б). Она экстрагировала муку и сырую клейковину 65%-ным этанолом при температуре 8—10, а затем в одном опыте отгоняла спирт в вакууме (при 35°) и лиофилизировала оставшийся глиадин, а в другом — непосредственно лиофилизировала спиртовой экстракт. Полученные препараты глиадина по ряду показателей были схожи с препаратами, выделенными из того же материала методами Осборна (в модификации Кизеля) и Кретовича, однако растворимость лиофилизированного белка в 65%-ном спирте была наивысшей. В то же время процент азота в лиофилизлрованных препаратах был слишком низким (17,01; 16,92), что свидетельствует о недостаточной их очистке. Во всяком случае, если методика, примененная Е. И. Медведевой, еще и не является вполне удовлетворительной, то в принципе она правильна и необходимо лишь доработать ее в отношении повышения чистоты получаемых препаратов.
Как видно из изложенного, не существует какой-либо стандартной методики выделения глиадина из пшеницы. Большинство исследователей выделяло и очищало белок различными способами, причем главным критерием, позволявшим считать полученный препарат глиадином, служила растворимость его в 60—70%-ном этиловом спирте. Возникает вопрос, в какой мере отдельные препараты глиадина являются идентичными и можно ли считать, что в составе клейковины имеется вполне определенный химически индивидуальный белок — глиадин. Осборн рассматривал глиадин именно как химически индивидуальное белковое вещество, причем его опыты, показавшие, что искусственное добавление глиадина к муке вызывает соответствующее увеличение отмываемой из нее клейковины, служили доказательством идентичности глиадина, содержащегося в зерне и полученного в виде препарата. Эти данные Осборна были впоследствии подтверждены В. Л. Кретовичем (1937), но они указывают лишь на отсутствие заметной денатурации той части клейковины, которая извлекается из нее спиртом и называется глиадином, доказательством же химической индивидуальности последнего они служить не могут.
Чтобы разобраться в сложном и не вполне еще ясном в настоящее время вопросе о химической индивидуальности глиадина, рассмотрим, от каких факторов зависит состав и физико-химические свойства его препаратов. Приведены некоторые данные о содержании азота, оптической активности и положении изоэлектрической точки глиадина, опубликованные различными авторами. Содержание азота в различных препаратах глиадина колеблется в довольно широких пределах.
Это зависит прежде всего от степени чистоты глиадиновых препаратов, поскольку неполное удаление сопутствующих веществ понижает процент азота в препарате. Однако помимо степени очистки существенную роль играет, по-видимому, и сама методика выделения глиадина в том смысле, что при неодинаковой методике не только меняется количество примесей, но получаются белки, не вполне идентичные по химическому составу. Действительно, если сопоставить содержание азота в препаратах глиадина со степенью их «чистоты», определяемой, например, по содержанию гуминового азота или золы, то видно, что эти показатели далеко не всегда согласуются. Так, в препарате глиадина, полученном Джонсом и Моллером, находилось 17,87% азота и 0,19’% золы, тогда как более чистый препарат В. В. Пономарева, в котором золы было только 0,045%, содержал лишь 17,33% азота. Глиадин, выделенный Куком, содержал 17,24% общего и только 0,0002% гуминового азота, т. е. был очищен много лучше, чем глиадин, полученный А. Р. Кизелем и сотр., содержавший 0,34% гуминового азота. Несмотря на это, процент общего азота в препарате А. Р. Кизеля составлял 18,20%, т. е. был значительно выше, чем в препарате Кука. Заметные различия наблюдаются между отдельными препаратами глиадина и в отношении величины удельного вращения спиртовых растворов этого белка. В то же время значения рН, соответствующие изоэлектрическому состоянию глиадина, довольно близко совпадают для разных препаратов.
Наиболее полную химическую характеристику глиадина получают путем количественного определения его аминокислотного состава. На протяжении полстолетия многие авторы определяли содержание тех или иных аминокислот в глиадине пшеницы, однако эти исследования в подавляющем большинстве были выполнены с помощью недостаточно точной и устаревшей в настоящее время методики, главным образом по схеме Ван-Слайка. Кроме того, в большинстве старых работ приводится лишь частичный аминокислотный состав глиадина, поскольку некоторые аминокислоты в то время вообще еще не были известны, а для других не существовало методов количественного определения. Позднее, когда появились очень точные микробиологические и хроматографические методы изучения аминокислотного состава белков, было опубликовано несколько отдельных анализов аминокислотного состава глиадина, однако подробного изучения состава этого белка в зависимости от методики его выделения, характера исходного материала и других факторов до сих пор проведено не было.
Для более полной характеристики глиадина пшеницы приведем как более новые, так и старые данные о его аминокислотном составе. Следует отметить, что сравнивать эти данные довольно затруднительно из-за неодинаковой методики выделения и очистки белка, а также определения аминокислот в опытах различных авторов.
Из приведенного материала видно, что содержание большинства аминокислот в отдельных препаратах глиадина колеблется очень сильно, однако неясно, от каких причин зависят эти колебания. Объяснять их только различиями в методах определения аминокислот не представляется возможным. Так, например, в большинстве старых работ применялся один и тот же метод Ван-Слайка, а результаты не получились идентичными. Использование более точных современных методов определения аминокислот также далеко не всегда дает совпадающие результаты. Например, М. С. Резниченко и сотр., а также В. М. Колесов с помощью хроматографии на бумаге нашли в глиадине 44,2% глютаминовой кислоты (что близко к старым данным), а Н. М. Сисакян и JI. С. Маркосян тем же методом — только 32,3%. Для того чтобы оценить причины наблюдаемых различий как в аминокислотном составе, так и в физико-химических свойствах отдельных препаратов глиадина, необходимо было бы сравнить состав и свойства этого белка, выделив его, во-первых, различными методами из одного и того же материала, и, во-вторых,— одним и тем же методом из неодинакового материала, т. е. из пшениц различных сортов, выращенных при разных, условиях и т. п. К сожалению, литературные данные по этим вопросам крайне ограничены и отрывочны, а главное — получены давно, с применением уже устаревшей и недостаточно точной методики.
Кук (Cook) в 1931 г. сравнил по некоторым показателям препараты глиадина. полученные им из одной и той же пшеницы пятью различными методами: 1) по Осборну, 2) по Диллу и Алсбергу, 3 и 4) по Блишу и Сандстедту (два варианта) и 5) по Куку. Содержание азота в указанных препаратах колебалось от 17,24 до 17,71%. Фракционирование азота по Гаусманну (азот гуминовый, амидный, аминный, аргининовый, а также фракции после осаждения гидролизата фосфорно-вольфрамовой кислотой) показало, что между отдельными препаратами глиадина нет существенных химических различий. В то же время измерение вязкости глиадиновых растворов в 60%-ном растворе этанола и 30%-ном растворе мочевины, а также определения растворимости препаратов глиадина в спирте привели автора к заключению, что по этим показателям препараты глиадина, полученные разными методами, не являются идентичными. Так, например, вязкость 4%-ных растворов исследованных препаратов в 30%-ном растворе мочевины колебалась от 2,64 до 5,91 сантипуазы, а критическая температура пептизации 1 — от 7,6 до 80—90°.
Критическая температура пептизации — это температура, при которой •начинается помутнение раствора глиадина.
Несколько позднее Синклер и Гортнер (Sinclair, Gortner, 1933) в результате почти аналогичного исследования состава препаратов глиадина, выделенных из одной и той же клейковины по Осборну и по Блишу и Сандстедту (в нескольких вариантах), также пришли к заключению об" отсутствии заметных химических различий между препаратами глиадина, полученными разными методами. Для тех же препаратов Уайлс и Гортнер (Wiles, Gortner, 1934) не нашли различий в оптической активности их растворов в ряде растворителей.
Шверт, Путнэм и Бриггс (Schwert, Putnam, Brigfgs, 1944) при исследовании гетерогенности глиадина методом электрофореза получили очень близкие результаты для препаратов этого белка, выделенных по Осборну и по Блишу и Сандстедту, что указывает на идентичность обоих препаратов, хотя и не совсем полную, поскольку некоторые различия между ними все же наблюдались.
Холм и Бриге (Holme, Briggs, 1959), изучая физическую природу глиадина с помощью электрофореза, также отметили отсутствие заметных различий в свойствах глиадиновых препаратов, полученных по Диллу и Алсбергу и по Блишу и Сандстедту.
Наконец, в недавнее время Е. И. Медведева (1958, 1959, 1960) провела сравнительное исследование препаратов глиадина, выделенных из одной и той же клейковины методами Кизе ля (модификация метола Осборна), Кретовича и Медведевой (лиофильная сушка спиртового экстракта). В полученных препаратах определялось содержание общего и аминного азота, количество гидроксильных групп тирозина, качественный аминокислотный состав (методом хроматографии на бумаге), растворимость в 65%-ном этаноле, оптическая активность и количество электрофоретически различимых фракций.
Исследованные препараты различались между собой по некоторым показателям, однако различия эти были невелики. Было бы желательно сопоставить количественное содержание аминокислот в препаратах глиадина, выделенных разными методами из одного и того же материала, используя для этого современную методику определения аминокислотного состава белков, в первую очередь хроматогоафическую. Но такие работы до настоящего времени не опубликованы и потому для суждения об идентичности препаратов глиадина, выделенных различными методами, приходится пользоваться только немногочисленными данными, которые были рассмотрены выше. На основании этих данных можно прийти к выводу, что при выделении разными методами препараты глиадина получаются схожими, но не вполне идентичными по составу и физико-химическим свойствам.
Возникает следующий вопрос: существуют ли различия между глиадинами, выделенными одним и тем же методом из неодинакового материала, например из пшениц разных сортов, пшениц одного сорта, но выращенных в разных условиях, из разных сортов муки, отличающихся по составу и «силе», из клейковины разного качества и т. п. Отрицательный ответ на этот вопрос указал бы на существование в зерне пшеницы одного и того же химически определенного белка — глиадина; положительный — на наличие ряда белковых веществ, условно объединяемых названием «глиадин» по общему признаку растворимости в 60—70%-ном растворе этанола.
Идентичность глиадинов, выделенных из неодинакового материала, изучалась в разных направлениях. Предположение, что аминокислотный состав глиадина неодинаков у пшениц разных ботанических сортов, было проверено в 1931 г. А. Кизелем, В. Новиковым и К. Сухоруковым, причем оказалось, что по содержанию общего азота и некоторых аминокислот заметных различий между глиадинами из трех чистолинейных пшениц не наблюдается и это дало авторам основание сделать вывод об идентичности исследованных ими белков. Несколько раньше к такому же заключению пришли Кросс и Свейн (Cross, Swain, 1924) в результате сравнительного определения ряда аминокислот (цистина, аргинина, гистидина, лизина, тирозина и триптофана) в составе глиадинов. выделенных в одинаковых условиях из пшениц четырех американских сортов, заметно различающихся по качеству муки.
В. Л. Кретович (Kretowitsch, 1936; 1937) сопоставил содержание некоторых аминокислот (гистидина, аргинина, моно-аминокислот и лизина) и удельное вращение глиадинов, выделенных одним и тем же методом (по Кретовичу) из пшеницы, пырея, ржано-пшеничного гибрида и ржи. Полученные результаты привели автора к выводу об идентичности глиадинов пшеницы, пырея и ржано-пшеничного гибрида, тогда как глиадин ржи оказался белком не идентичным с остальными. 20 лет спустя В. М. Колесов (1957) повторил работу В. Л. Кретовича и, применив современный метод количественного определения аминокислот — хроматографию на бумаге, показал, что глиадины пшеницы и пырея (последний назван автором «пыреином») не являются идентичными вследствие сильного различия в содержании некоторых аминокислот, особенно глютаминовой кислоты, пролина, серина, гликокола и треонина, т. е. тех компонентов белка, которые в 1937 г. еще не могли быть учтены из-за отсутствия в то время соответствующей методики.
В самое последнее время Н. А. Тиунова (1960) провела сравнительное изучение глиадинов пшеницы (сорт Лютесценс 329), пырея (Agropyrum glaucum) и их гибрида — новой многолетней формы пшеницы «М2» — методом диффузионного высаливания по Зеленскому (1959). Белки высаливались возрастающими концентрациями сульфата аммония как в щелочной (рН = 9,0), так и в кислой (рН = 2,5) среде. Кривые высаливания имели одинаковый характер для глиадинов всех трех злаков, но наблюдались и определенные различия в том отношении, что глиадин пырея высаливался труднее, чем глиадин пшеницы, а глиадин гибрида занимал между ними среднее положение. Определение концевых аминокислот в исследованных глиадинах показало, что по этому признаку все три белка были идентичными.
В разделе об аминокислотном составе клейковины уже упоминалась обстоятельная работа Пенса, Мичема, Элдер и др. (Репсе, Mecham, Elder, Lewis, Snell, Olcott, 1950), показавшая, что аминокислотный состав клейковины из 17 американских сортов пшеницы, резко различающихся по содержанию белка в муке (от 5,7 до 14,2%) и по хлебопекарным качествам, оказался почти совершенно идентичным.
Указанные авторы определили количественное содержание в клейковине восемнадцати аминокислот, используя современную микробиологическую методику. Аминокислотный состав глиадина в тех же пшеницах не определялся, но поскольку не было заметных различий в аминокислотном составе целой клейковины, трудно предполагать, чтобы глиадины этих пшениц значительно отличались друг от друга. Таким образом, если и не прямо, то косвенно данные Пенса и сотр. указывают на вероятную идентичность глиадинов в пшеницах разных сортов и разного хлебопекарного качества.
В старой литературе имеются также сравнительные данные по оптической активности препаратов глиадина, выделенных из пшениц различных сортов и различной хлебопекарной «силы». Вудмен (Woodman, 1922), Гальтон (Halton, 1924), Блиш и Пинкни (Blish, Pinckney, 1924), Дингуэлл (цит. по Bailey, 1944), Кондо и Ямада (цит. по Bailey) исследовали величину удельного вращения, скорость рацемизации, показатель преломления и абсорбционный спектр препаратов глиадина, выделенных из пшениц с резко различными хлебопекарными качествами, причем все изученные глиадины оказались идентичными. Наконец, необходимо упомянуть недавнюю работу Е. И. Медведевой (1960), показавшую, что при исследовании методом электрофореза на бумаге двух препаратов глиадина, выделенных из пшениц разного сорта, выращенных в неодинаковых условиях (в Москве и в Одессе), результаты получаются очень близкими как по числу наблюдаемых фракций, так и по их распределению в электрическом поле.
Таким образом, на основании имеющихся данных об аминокислотном составе глиадина и его физико-химических свойствах, создается впечатление, что при одинаковой методике выделения и очистки из различных пшениц можно получить один и тот же химически индивидуальный белок — глиадин. В последнее время, однако, была опубликована работа Н. М. Сисакяна и Л. С. Маркосяна (1959), результаты которой находятся в противоречии с изложенными выше данными. Указанные авторы подробно исследовали с помощью хроматографии на бумаге аминокислотный состав глиадинов, выделенных методом Кретовича из двух сортов пшеницы, выращенных в трех районах Армянской ССР с неодинаковыми почвенно-климатическими условиями. Содержание всех аминокислот в белках из различных пшениц колеблется очень сильно. Разница между отдельными аминокислотами в препаратах глиадина из разных пшениц достигает нередко 50, 70 и даже 100%. Для того чтобы выяснить причины столь сильных колебаний, авторы сопоставили аминокислотный состав глиадинов, выделенных из пшениц разных сортов, выращенных в одном районе, и из пшениц одного и того же сорта, но выращенных в разных районах.
Авторы приходят к выводу, что как условия выращивания, так и биологические особенности сорта являются одинаково существенными факторами, определяющими количественное содержание аминокислот в глиадине пшеницы. Следует отметить, что такие же результаты получены Н. М. Сисакяном и Л. С. Маркосяном и в отношении других белков пшеничного зерна — альбуминов и глобулинов.
В последнее время помимо общего аминокислотного состава глиадина началось исследование его N — и С-концевых аминокислот, т. е. тех аминокислот, которые находятся в конце каждой из полипептидных цепей, составляющих молекулу глиадина, и обладают свободной аминной (N-концевая) или карбоксильной (С-концевая) группой. Наибольшее число работ в этом направлении посвящено изучению N-концевых групп глиадина, так как для характеристики концевых аминокислот со свободной аминной группой в настоящее время разработано несколько методов, важнейшим из которых является метод Сешкера (Sanger, 1945). Принцип этого метода состоит в обработке белка 2,4-динитрофторбензолом, причем получается динитрофторфенильное производное белка, в котором указанный реактив блокирует свободные концевые аминные группы белковой молекулы. При последующем кислотном гидролизе внутренние аминокислоты белка, связанные в его молекуле пептидной связью, становятся свободными, тогда как концевые аминокислоты переходят в гидролизат в виде своих динитрофторфенильных производных (ДНФ-аминокислоты), определяемых затем с помощью хроматографии на бумаге путем идентифицирования с заранее приготовленными ДНФ-производными чистых препаратов различных аминокислот.
Результаты качественного определения концевых аминокислот глиадина со свободными аминными группами (N-концевых аминокислот), показывают, что между данными отдельных авторов существуют большие расхождения, что объясняется, по-видимому, применением различных вариантов методики, требующих дальнейшего уточнения и разработки. Концевые аминокислоты глиадина со свободными карбоксильными группами (С-концевые аминокислоты) почти совершенно не исследованы из-за методических трудностей их определения. В литературе имеются лишь данные Рамачандрана и Мак-Коннелла (Ramachanciran, McConnell, 1955) о содержании в глиадине С-концевых глютаминовой кислоты и лейцина, а также данные В. А. Векслера и А. А. Фрейман (цит. по М. С. Резниченко, I960), согласно которым в глиадине находятся С-концевые аспарагиновая и глютаминовая кислоты. Дальнейшие исследования аминокислот, стоящих в конце полипептидных цепей глиадина, очень желательны, так как они проливают свет на внутреннее строение молекулы этого белка.
Рассмотрим далее вопрос о физико-химической гомогенности глиадина или, вернее, каждого из тех глиадинов, которые могут быть выделены из зерна пшеницы при определенных условиях и являются составной частью клейковины.
После классических работ Осборна долгое время считалось, что глиадин представляет собой вполне определенное, химически индивидуальное, однородное белковое вещество, тогда как клейковина является гетерогенным образованием, составленным из двух индивидуальных белков: глиадина и глютенина. Впоследствии выяснилось, что очень многие белки как растительного, так и животного происхождения не являются химически индивидуальными веществами, но могут быть разделены на ряд фракций. Даже такой относительно просто построенный белок, как желатина, состоит из нескольких фракций, отличающихся друг от друга по растворимости, весу, осмотическому давлению и удельному вращению водных растворов (Путилова, 1935; Липатов, 1941). Столь же неоднородными оказались казеин, гемоглобин, белки кровяной сыворотки (Sorensen, 1930), зеин кукурузы (Watson, Arrheniijs, Williams, 1936; Foster, Yen Tsi Yang, Vui, 1950; Медведева, 1960), гордеин ячменя (Waldschmidt-Leitz, Brutschek, 1958; Waldschmidt-Leitz, Kloots, 1959; Медведева, I960), глиадин ржи (Медведева, 1960) и многие растительные альбумины и глобулины, например белки гороха (Wetter, McCalla, 1949; Кретович, Бундель, Мелик-Саркисян и Степанович, 1954), тыквы (Кретович, Бундель, Лепина, Мелик-Саркисян, 1956), сои (Briggs, Mann, 1950; Naismith, 1955; Кретович, Смирнова и Френкель 1956, 1958; Кретович, Смирнова, Вейнова, 1958; Смирнова, Поглазов, Кретович, 1959), конопли (Кретович, Смирнова, Вейнова, 1958), а также альбумины и глобулины зерна пшеницы (Krejci, Svedberg, 1935; Репсе. Elder, 1953; Репсе, 1953; Тиунова, 1960).
На основании многих исследований в настоящее время установлено, что глиадин пшеницы также не является однородным, химически индивидуальным белком, но в зависимости от условий опыта его можно разделить на несколько фракций. Так, еще в 1930 г. Хаугаард и Джонсон (Haugaard, Johnson, 1930), применяя последовательное охлаждение спиртового раствора глиадина до 0° и до — 11°С, получили 3 фракции: белок, оседающий из раствора при 0°, белок, оседающий при —11°, и белок, остающийся в растворе. Все 3 фракции, а также исходный глиадин были получены в виде обезвоженных препаратов, заметно различавшихся по растворимости, вязкости спиртовых растворов, оптическому вращению и содержанию некоторых аминокислот, тогда как способность связывать щелочь и кислоту, а также изоэлектрическая точка оставались для всех фракций приблизительно одинаковыми.
В 1933 г. Синклер и Гортнер (Sinclair, Gortner, 1933) разделили глиадин на 2 фракции: растворимую и нерастворимую в молярном растворе йодистого калия. После перерастворения в 70%-ном спирте и обезвоживания обе фракции были получены в виде сухих препаратов, каждый из которых вновь мог быть разделен на 2 части по признаку растворимости в молярном йодистом калии. Авторы пришли к заключению о физической гетерогенности глиадина, обусловливаемой наличием в нем белковых мицелл различной величины, хотя и одинакового химического состава.
Несколько позднее гетерогенность глиадина была подтверждена Крейси и Сведбергом (Krejci, Svedberg, 1935), показавшими, что в зависимости от рН среды и температуры молекулярный вес глиадина, определяемый методом седиментационного равновесия (с помощью ультрацентрифуги) подвергается сильным изменениям. Авторы пришли к выводу, что глиадин представляет смесь целых и половинных молекул, имеющих молекулярный вес, равный соответственно 34 500 и 17 250, причем последние образуются путем диссоциации первых, а интенсивность этого процесса определяется температурой и кислотностью среды. От соотношения количеств целых и диссоциированных молекул зависит в каждом случае реально наблюдаемый молекулярный вес глиадина.
Те же авторы подвергли глиадин разделению па три фракции по Хаугаарду и Джонсону, причем оказалось, что каждая из этих фракций (за исключением наиболее растворимой) является, в свою очередь, гетерогенной по молекулярному весу. Годом позднее к тем же выводам пришли Лэмм и Полсон (Lamm, Poison, 1936), показавшие с помощью рефрактометрического метода существование различий между величинами диффузионных констант исходного глиадина и трех его фракций, полученных по Хаугаарду и Джонсону, причем по характеру кривых диффузии было сделано заключение, что каждая из фракций (за исключением наиболее растворимой) также неоднородна, т. е. состоит из частиц неодинаковой величины.
В 1937 г. Кульман (Kuhlmann, 1937; Кульман, 1937, 1949, 1953) показал, что обычный глиадин, извлекаемый по Осборну 70%-ным спиртом, состоит из двух фракций: а-глиадина и р-глиадина. а-глиадин экстрагируется из клейковины 40%- ным этиловым спиртом, а р-глиадин представляет, собой белок, извлекаемый 70%-ным спиртом из остатка клейковины после удаления а-глиадина. Обычный глиадин Осборна является, по Кульману, адсорбционным соединением а — и р-глиадинов со значительным количественным преобладанием первого.
Мицеллярный вес а-глиадина равен 28 000, а р-глиадина — 47 000. Кроме того, обе фракции различаются между собой по гидратационной способности, вязкости уксуснокислых золей и по величине теплоты гидратации. Средний молекулярный вес глиадина, не разделенного на фракции, был найден равным 41 000.
Дальнейшее подтверждение неоднородности глиадина было дано в работе Бэрка (Burk, 1938) на основании определений молекулярного веса белка по осмотическому давлению его растворов. При этом была отмечена относительно высокая стабильность глиадиновых мицелл, вследствие чего последние не подвергаются диссоциации, например в растворах мочевины, под влиянием которой у многих других белков происходит заметное снижение молекулярного веса (Burk, Greenberg, 1930; Burk, 1937). В то же время в растворах глицерина молекулярный вес глиадина заметно повышается вследствие ассоциации его молекул в более крупные агрегаты.
Бармор (Barmore, 1947) разделил глиадин на две фракции, различавшиеся между собой по растворимости, вязкости спиртовых растворов и по форме белковых молекул, определяемой величиной так называемого осевого отношения, т. е. отношения длины молекулы к ее толщине. При этом оказалось, что чем меньше растворимость глиадиновой фракции, тем выше вязкость ее спиртового раствора и тем более удлиненными являются молекулы, составляющие данную фракцию.
В недавней работе Н. А. Тиунова (1960) показала с помощью метода диффузионного высаливания, что глиадин пшеницы, так же как и проламины пырея и пшенично-пырейного гибрида, не является гомогенным белком, но состоит из нескольких компонентов или фракций, разделяемых при различной степени насыщения раствора белка сульфатом аммония.
За последнее десятилетие широкое распространение получил метод исследования гомогенности белков с помощью электрофореза их растворов в различных буферных смесях при определенных условиях кислотности и ионной силы среды. Новейшей модификацией этого метода является электрофорез на бумаге. Метод электрофореза позволяет не только определить число индивидуальных компонентов или фракций в исследуемом белке, но и установить существование взаимодействия между ними, а также до известной степени и характер этого взаимодействия. Глиадин пшеницы был впервые исследован электрофоретическим методом Швертом, Путнэмом и Бриггсом в 1944 г. (Schwert, Putnam, Briggs, 1944). На четырех препаратах белка, при значительном варьировании условий опыта — рН, ионной силы, концентрации белка, характера буферной смеси—указанные авторы показали, что глиадин не является гомогенным белковым веществом, но состоит из нескольких (по меньшей мере из двух) компонентов, которые находятся между собой в определенном взаимодействии. Это взаимодействие не является только ионным, т. е. не обусловлено лишь противоположными электрическими зарядами компонентов, но имеет, по-видимому, более сложную природу, хотя ионная связь также не исключается, поскольку изоэлектрические точки двух изолированных фракций глиадина — «быстрой» и «медленной» — оказались различными (рН 7 для «быстрой» и рН 5 для «медленной» фракции).
Авторы отмечают, что оба компонента глиадина, изолированные с помощью электрофореза, также не являются гомогенными, но в свою очередь состоят из нескольких взаимодействующих фракций. Десять лет спустя Миллс (Mills, 1954) подробно исследовал глиадин пшеницы методом электрофореза в различных буферных смесях в зависимости от рН, концентрации белка и ионной силы раствора. Опыты Миллса показали, что глиадин состоит, по меньшей мере, из четырех отдельных компонентов. В зависимости от состава среды эти компоненты могут передвигаться в электрическом поле самостоятельно или же агрегироваться в комплексы, состоящие только из двух или из большего числа компонентов. Естественный глиадин, растворимый в 70%-ном спирте, представляет собой, по мнению Миллса, довольно стабильный комплекс из четырех компонентов или фракций. Колебания молекулярного веса, получаемые для глиадина при разных условиях, зависят, вероятно, от неодинакового агрегирования его компонентов при измерении в растворах, различных по составу, рН, ионной силе и т. д.
Е. И. Медведева (1958, 1960а, б) подтвердила данные Миллса, показав методом электрофореза на бумаге при рН 2,81 и 11,0, что глиадин пшеницы состоит из четырех отдельных фракций. Такое же число фракций содержат глиадин ржи и гордеин ячменя, в то время как спирторастворимый белок кукурузы — зеин — состоит из трех фракций.
Джонс, Тэйлор и Сенти (Jones, Taylor, Senti, 1959) с помощью электрофореза в аппарате Тизелиуса разделили глиадин на четыре компонента, содержавшие 55, 22, 20 и 3% от общего количества белка.
В последнее время электрофоретическую гетерогенность глиадина пшеницы исследовали также Холм и Бриггс (Holme, Briggs, 1959), обнаружившие, однако, в глиадине только три отдельных компонента.
Подводя итоги изложенному материалу о неоднородности глиадина пшеницы, можно считать твердо установленным, что глиадин не является химически индивидуальным гомогенным белковым веществом. Гетерогенность глиадина доказана самыми различными методами, включая фракционирование его по растворимости, ультрацентрифугирование, рефрактометрию, осмотические измерения, электрофорез, и потому не вызывает сомнений.
Остановимся вкратце на вопросе о растворимости глиадина пшеницы и тех изменениях его физико-химических свойств, которые наблюдаются при денатурации этого белка. Оба эти вопроса тесно связаны между собой, так как о денатурации под влиянием каких-либо воздействий судят, прежде всего, по уменьшению растворимости глиадина.
Хотя основной характерной особенностью глиадина как белка, принадлежащего к группе проламинов, считается его растворимость в 60—70%-ном этиловом спирте, известно, что глиадин легко растворяется и во многих других растворителях. Еще в 1925 году Тэг (Tague, 1925) подробно изучил растворимость глиадина в растворах различных кислот, щелочей и солей. Наилучшее растворение наблюдалось в 10 п уксусной кислоте, а также в разбавленных серной кислотой при концентрациях их от 0,01 до 0,001 нормальной. Для всех кислот максимальная растворимость глиадина отмечена при рН около 2,0. а минимальная — пои рН 6,5и 8,0. Глиадин хорошо растворим в растворах едкого натрия или калия и плохо — в растворах углекислого натрия. Водные растворы нейтральных солей в большинстве случаев растворяют глиадин очень плохо, за исключением растворов хлористого магния. Данные о растворимости глиадина в водных растворах галоидных солей при различных концентрациях последних (от 0.25 до 2.0 п) имеются в работе Синклера и Гортнера (Sinclair, Gortner, 1933). При четырехкратном экстрагировании препарата глиадина 100 частями нормальных растворов хлористого, бромистого и йодистого калия в раствор перешли следующие количества белка в процентах от исходного его количества.
Подробное исслелование растворимости чистого пшеничного глиадина в растворах различных органических и неорганических веществ было выполнено Диллом и Алсбергом (Dill, Alsberg, 1925).
Кроме того, было показано, что при комнатной температуре глиадин образует прозрачные растворы в следующих растворителях: глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоли, смесь глицерина с абсолютным этиловым спиртом (25% глицерина), смесь воды с 10—25% метил-этил-кетона. Насыщенные водные растворы азотнокислого и хлористого аммония не растворяют глиадин. Более подробное изучение условий растворимости глиадина в различных спиртах показало, что легче всего он растворяется в пропиловом, затем в этиловом и труднее всего в метиловом спирте. При температуре 20° диапазон концентраций, растворяющих глиадин, составляет для пропилового спирта 17—72%, а для этилового — 35—77%. Повышение температуры до 44° приводит к растворению глиадина даже в 10%-ном этаноле.
Так как общепринятым растворителем для глиадина служит 60—70%-ный этиловый спирт, то по уменьшению растворимости именно в этом растворителе судят обычно о степени денатурации белка в результате тех или иных воздействий. Этанол, хотя и является хорошим растворителем глиадина, оказывает на него некоторое денатурирующее действие, зависящее от концентрации спирта в водном растворе. Работами Дилла и Алсберга (Dill, Alsberg, 1925), а также А. Кизеля, В. Новикова и К. Сухорукова (1931) установлено, что даже 70%-ный этиловый спирт при продолжительном настаивании с мукой или препаратом глиадина уменьшает растворимость этого белка. Применение более низких и более высоких (чем 70%) концентраций этанола заметно усиливает денатурацию глиадина. Готтенберг и Алсберг (Gottenberg, Alsberg, 1927) подробно изучили изменение растворимости препаратов глиадина в 20-90%-ных водных растворах этилового спирта после хранения их в течение 4, 9 и 15 дней при температурах 4; 25; 37 и 58°. Было показано, что 20—30%-ные растворы этанола денатурируют глиадин даже при низкой температуре (+4°). Аналогично действует 80%-ный спирт, тогда как промежуточные концентрации — 40, 50, 60 и 70% —при обычной температуре очень мало снижают растворимость глиадина. Помимо спирта, денатурирующее действие на глиадин оказывают и другие вещества, в частности мочевина, водные растворы которой применяются, как указывалось выше, в качестве растворителя для клейковинных белков. Сравнительное изучение молекулярных весов некоторых белковых веществ в растворах мочевины привело Бэрка (Burk, 1937, 1938) к заключению о большой устойчивости глиадина по отношению к денатурирующему действию этого реагента. Некоторая денатурация глиадина под влиянием мочевины обнаруживалась по появлению в его молекуле дисульфидных групп, которые вновь исчезали после удаления мочевины диализом, что указывает на полную обратимость денатурации.
Наибольшее число работ посвящено тепловой денатурации глиадина. Этот процесс представляет большой интерес в связи с проблемами тепловой сушки зерна повышенной влажности. Как известно, сушка пшеницы оказывает большое влияние на ее качество, причем правильно выбранные режимы тепловой сушки могут при известных условиях улучшать физические свойства клейковины, что повышает качество зерна, тогда как неправильные режимы приводят к ухудшению качества и даже порче зерна. Изменения качества пшеницы при сушке зависят в основном от степени денатурации белковых веществ зерна под влиянием тепла и влаги, вследствие чего изучение условий и характера тепловой денатурации клейковины и составляющих ее белков приобретает большое практическое значение. В литературе имеется много работ, посвященных непосредственно изменениям клейковины при тепловой сушке. Эти работы будут рассмотрены ниже в главе о денатурации клейковины. Для расшифровки суммарного изменения клейковины под влиянием тепла неоднократно проводилось изучение тепловой денатурации ее составной части — глиадина. Еще в 1935 г. В. JI. Кретович и Е. Н. Рязанцева (1936, 1937) наблюдали значительное уменьшение содержания спирторастворимого белка в муке влажностью 11—13%, подвергнутой прогреванию при 90—130° в течение 3—6 часов.
Последующими работами многих авторов — В. Л. Кретовича (1945), И. И. Ленарского (1948, 1951, 1955), Н. И. Соседова и 3. Б. Дроздовой (1949), В. Л. Кретовича, А. А. Бундель, Т. И. Смирновой, 3. Н. Галачаловой и др. (1954), П. Н. Платонова и В. И. Жидко (1955) и других — было установлено, что растворимость глиадина, определяемая по содержанию спирторастворимого азота в зерне, снижается при прогревании последнего тем сильнее, чем выше температура и влажность зерна и чем больше продолжительность нагревания. В опытах И. И. Ленарского (1951) повышение температуры нагрева зерна при постоянной влажности на 10° увеличивало скорость денатурации глиадина в 2—4 раза. Увеличение влажности зерна на 3—4% было приблизительно эквивалентно повышению температуры на 10°. Снижение растворимости глиадина в результате тепловой денатурации на 8—9% резко ухудшало качество клейковины, а при денатурации глиадина свыше 15% клейковину отмыть не удавалось (Ленарский, 1955).
Измерив степень снижения содержания глиадина в зерне при разных сочетаниях температуры и влажности, И. И. Ленарский (1951), а позднее П. Н. Платонов и В. И. Жидко (1955) получили эмпирические кривые, определяющие графически границу безопасного нагревания зерна заданной влажности. В зависимости от качества исходной клейковины зона безопасного нагрева
Зерна одной и той же влажности может смещаться в сторону более высоких или более низких температур. Это обстоятельство получило свое отражение и в эмпирических формулах
Зависимости величины безопасной температуры нагрева зерна с нормальной и крепкой
Клейковиной от влажности зерна в интервале 15—34%, предложенных П. Н.Платоновым и В. И. Жидко (1955). Какие же изменения происходят с молекулой глиадина при тепловой денатурации? И. И. Ленарский (1951) на основании своих опытов считает, что этот процесс протекает с присоединением воды к глиадину и потому представляет собой бимолекулярную реакцию. Увеличение сухого веса глиадина при тепловой денатурации позволило И. И. Ленарскому подсчитать, что каждая молекула белка присоединяет к себе 7 молекул воды. Бимолекулярный характер реакции объясняет увеличение скорости тепловой денатурации
При повышении влажности зерна (по закону действия масс).
Изменение физико-химических свойств глиадина при тепловой денатурации было подробно исследовано за последнее время В. В. Пономаревым и сотрудниками (Пономарев, 1951; Орлова, Пономарев, Тонгур, 1954; Пономарев и Лифанова, 1956). Указанные авторы денатурировали сухие препараты глиадина (с влажностью 8,5%) путем нагревания их при разных температурах (40, 70, 130, 150°) на протяжении различных отрезков времени (1—4 часа). В результате денатурации наблюдались следующие изменения свойств глиадина: 1) уменьшение растворимости в 70%-ном этаноле; 2) снижение удельного вращения спиртовых растворов; 3) увеличение набухаемости в воде; 4) увеличение вязкости спиртовых растворов; 5) уменьшение молекулярного веса (определяемого по осмотическому давлению спиртовых растворов); 6) увеличение теплоты сгорания и теплоты взаимодействия со спиртом; 7) разрушение кристаллической решетки (по рентгенографическим измерениям). В качестве примера приведем данные В, В. Пономарева (1951) об изменении молекулярного веса глиадина в результате тепловой денатурации.
По данным В. В. Пономарева и Т. А. Лифановой (1956) начало внутримолекулярных изменений в глиадине, содержащем 8,5% влаги, происходит при нагревании его в интервале от 40 до 50°. Если спиртовой раствор глиадина, денатурированного нагреванием, подвергнуть давлению 2000 атмосфер в течение 20 часов, то происходит частичная регенерация первоначальных свойств белка, определяемая по изменениям растворимости глиадина, вязкости, мутности и оптической активности его спиртовых растворов, а также по способности белка расщепляться трипсином. Все же регенерированный под давлением глиадин остается по своим свойствам ближе к денатурированному, чем к исходному (Орлова, Пономарев, Тонгур, 1954), что указывает на неполную обратимость денатурационного процесса.
Е. И. Медведева (1959, 1960) приготовила препараты пшеничного глиадина с содержанием влаги 14,2; 18,1 и 20,4% и подвергла каждый из них нагреванию в условиях постоянной влажности при 40—70° в течение 15—60 минут. Исследование ряда химических и физико-химических свойств полученных препаратов — содержания в них аминного азота и гидроксильных групп тирозина, качественного аминокислотного состава, растворимости в 65%-ном этаноле, оптической активности спиртовых растворов, количества электрофоретически определяемых фракций — привело автора к представлению о двух стадиях процесса тепловой денатурации глиадина. Первая стадия обнаруживается по незначительному» падению растворимости глиадина и некоторому повышению реактивности его функциональных групп — аминных и гидроксильных, сопровождаемому увеличением удельного вращения спиртовых растворов. Вторая стадия денатурации характеризуется снижением количества аминного азота и гидроксильных групп тирозина, резким падением растворимого белка, уменьшением его оптической активности и изменением числа электрофоретически определяемых фракций с четырех, до трех за счет слияния двух наиболее подвижных фракций в одну. Денатурация глиадина, характеризуемая любым из исследованных показателей, достигает тем большей величины, чем выше исходная влажность белка, температура и экспозиция нагревания. Действие каждого из этих факторов можно проследить на примере снижения растворимости глиадина в 65%-ном этаноле в результате тепловой денатурации.
Почти совершенно не исследована до настоящего времени денатурация глиадина, происходящая под действием ионизирующих излучений. При облучении зерна пшеницы высокой влажности (25—26%) дозами гамма-лучей свыше 2—3 миллионов рентген происходит заметное снижение содержания в нем спирторастворимого азота, т. е. растворимость глиадина падает.
В молекуле глиадина происходят при этом определенные изменения, поскольку об этом можно судить на основании спектрофотометрической характеристики спиртоворимого белка, выделенного из облученного зерна. Под влиянием гамма-лучей (дозы 5—10 млн. р.) интенсивность поглощения света глиадином меняется как в ультрафиолетовой, так и в инфракрасной области спектра. О структурных изменениях в молекуле облученного глиадина свидетельствует также резкое снижение его способности расщепляться папаином. Наконец, по данным Резниченко и Полотновой (1960), глиадин, выделенный из зерна, облученного при высоком содержании влаги (26%) гамма-лучами в дозе 20 миллионов рентген, не содержит в своем составе концевой глютаминовой кислоты со свободной аминной группой, наличие которой характерно для глиадина нормального зерна. Все это указывает на существенное изменение структуры глиадина под влиянием гамма-лучей, хотя природа этих изменений остается пока совершенно неисследованной.