Факультет

Студентам

Посетителям

Гистологическое и гистохимическое изучение почвообитающих беспозвоночных

Л. М. Семенова

Методы исследования структур органов и тканей животных весьма разнообразны.

Существует много руководств, где достаточно подробно изложены методы анатомической и микроскопической техники, т. е. техники изготовления фиксированных и окрашенных препаратов, главным образом для целей общей и частной гистологии (Ромейс, 1953), Пирс, 1962; Роскин, Левинсон, 1957; Касили, 1962 и др.).

Однако большинство методов гистологического исследования разработано на тканях позвоночных животных.

Приведен обзор методов гистологического исследования тканей и органов беспозвоночных, главным образом, почвенных. Все эти методы являются модификациями ранее известных методов. Однако они разработаны с учетом морфологических особенностей почвенных беспозвоночных. В тех случаях, когда для исследования фиксируется целое животное, выбор способов и продолжительности фиксации определяется характером склеротизации кутикулы, размером животного. Для препаровки беспозвоночных используются препаровальные иглы, тонкие хирургические ножницы, тонкие пинцеты.

Лучшими фиксирующими смесями являются следующие; жидкости Буэна, Ценкера, Карнуа, Шабадаша (Ромейс, 1953; Роскин, Левинсон, 1957; Касили, 1962). Эти смеси быстро проникают в ткани и могут быть рекомендованы как для обзорных препаратов, так и для тонких исследований.

Для приготовления жидкости Буэна нужно смещать 15 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты с 5 мл формалина и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Продолжительность фиксации материалов в этой жидкости в зависимости от размеров объекта — от двух до нескольких суток. После фиксации материал переносят в 70%-ный спирт, который несколько раз отменяют, до полной отмывки фиксатора, т. е. до исчезновения желтой окраски.

Жидкость Ценкера готовят из расчета: 5 г сулемы, 2,5 г двухромовокислого калия, 1 г сернокислого натрия на 100 мл дистиллированной воды. Хранить эту смесь следует в посуде из темного стекла. Фиксацию нужно проводить только в темноте в течение 24-х часов. После фиксации материал промывают в проточной воде в течение суток для полного удаления из объекта двухромовокислого калия. Затем объект переносится в 70%-ный спирт, к которому добавляют капли спиртового раствора йода (до приобретения раствором цвета коньяка), и ставят в темное место. Постепенно спирт обесцвечивается и к нему добавляют новые порции йода. Добавление йода повторяют до тех пор, пока обесцвечивание спирта полностью не прекратится. После этого объекта отмывают в нескольких порциях 70%-ного спирта в течение 2—3 суток, до полного удаления йода. Йодирование материала проводят для удаления сулемы, кристаллы которой могут искажать окраску и затруднять рассмотрение препарата.

Хорошие результаты исследований получаются после фиксации объектов в жидкости Карнуа. Эту жидкость составляют из расчета: 60 мл абсолютного спирта, 30 мл хлороформа и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Эта фиксирующая смесь очень быстро проникает в ткани. Объекты диаметром в 2 мм оказываются зафиксированными уже через час, а при толщине 5 мм — через 4—5 час. После фиксации объект переносят в абсолютный слирт.

Фиксирующая смесь Шабадаша состоит из 100 мл 96°-ного спирта, 1,8 г азотнокислой меди, 0,9 г азотнокислого кальция и 10 мл 40%-ного формалина. Объекты толщиной до 5 мм фиксируются в течение трех часов. Зафиксированный материал промывают, несколько раз сменяя 96%-ный спирт, в течение 6—12 час.

Объекты исследования, предназначенные для заливки в парафин, после отмывки фиксирующей жидкости следует обезводить. Обезвоживание осуществляется постепенно, путем переноса из слабых спиртов в крепкие. Исключение составляют объекты, фиксированные в смесях Карнуа и Шабадаша, которые сразу переносят в абсолютный спирт. Обычно достаточно провести объекты после отмывки фиксаторов через 2—3 порции 70°-ного спирта, одной порции 80°-ного и 2 порции 96°-ного. Длительность выдерживания объектов в спиртах зависит от их величины. Отпрепарированные отдельно органы достаточно выдери жать в 70°- и 80°-ном спирте всего 6—8 час., в 96°-ном — 6 час. (по три часа в каждой порции). Объекты, представляющие собой большие участки тела или целые организмы, следует держать в 70°-ном спирте — 24 часа, в 80°-ном —12 час., в 96°-ном —10—12 час.

Обезвоживание объектов в абсолютном спирте (две порции) нужно производить в течение 12—15 час.: при передержке ткани становятся твердыми и ломкими. Затем объекты переносятся в смесь, состоящую из равных частей 100°-ного спирта и ксилола, на 2—3 часа, в чистый ксилол на 30—60 мин. и, наконец, в смесь равных частей расплавленного парафина и ксилола в термостате при 37°. Отдельные органы в этой смеси достаточно держать 1,5—2 часа, а крупные участки тела или целое животное — до 4 час. Затем объекты переносят в чистый расплавленный парафин, находящийся в термостате при 60е. Желательно иметь две смены парафина. В парафине мелкие объекты достаточно держать по 1 часу в каждой порции, а крупные — по 1,5 часа.

При обезвоживании абсолютный спирт может быть заменен метилбензоатом. Материал после выдерживания в 2—3 порциях 96в-ного спирта переносят в метилбензоат. Срок выдерживания в метилбензоате не ограничен, материал может даже храниться в нем, так как ткани не сжимаются. Из объектов, залитых в парафин, приготовляют срезы. Для обзорных препаратов пригодны срезы толщиной 10 мк, для исследования клеточных структур необходимы срезы в 6—7 и меньше микрон. Ленточки срезов помещают в дистиллированную воду, налитую на предметные стекла, смазанные яичным белком. Стекла со срезами помещают на подогреваемый до 40° столик для расправления гистологических препаратов, затем удаляют фильтром излишек воды и переносят стекла для подсушивания в термостат при 37°.

Обзорные препараты окрашиваются различными смесями с гематоксилином или по методу Маллори в различных его модификациях. Из красящих растворов гематоксилина рекомендуются железный гематоксилин по Гайденгайну, кислый раствор гемалауна по Майеру.

Железный гематоксилин готовят следующим образом. 0,5 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96%-ного спирта и разбавляют 90 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в открытой колбе в течение 4—5 недель. Перед употреблением раствор фильтруют и разбавляют равным количеством дистиллированной воды. Перед окраской железным гематоксилином срезы, освобожденные от парафина, необходимо обработать раствором железных квасцов (10 г светло-фиолетовых кристаллов железных квасцов на 100 см дистиллированной воды). Препараты выдерживаются в растворе железных квасцов 3—6 час., после чего ~их споласкивают дистиллированной водой и переносят в раствор железного гематоксилина на 1—5 час. Затем стекла со срезами вынимают, ополаскивают дистиллированной водой и снова помещают в раствор железных квасцов для дифференцировки. Степень дифференцировки контролируют, время от времени вынимая препараты и рассматривая их под микооскопом. При окраске железным гематоксилином хорошо выявляются внутриклеточные структуры (хроматин, ядрышки, гранулы, митохондрии).

Для приготовления кислого гемалауна по Майеру 1 г гематоксилина раствбряют в 1000 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 г иодноватокислого натрия (NaIOs) и 50 г химически чистых калийных квасцов. После полного растворения солей к раствору добавляют 50 г хлоральгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты. Раствор сразу Готов к употреблению. Препараты, освобожденные от парафина, из дистиллированной воды помещают в краску на 10—15 мин., затем промывают в проточной воде. В результате окраски ядра клеток становятся ярко-синими, хорошо различимы границы клеток, клеточные включения окрашиваются в серовато-синий цвет.

Окраску по Маллори проводят следующим образом. Срезы помещаются в 0,1%-ный водный раствор кислого фуксина на 3 мин., промывают в воде, после чего переносятся в 1%-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты на 5 мин. Затем препараты снова промывают в воде и помещают на 2 мин. в раствор, состоящий из 0,5 г анилинового синего, 2 г оранжевого, 2 г щавелевой кислоты, и 100 мл дистиллированной воды. После этого срезы промывают в воде, проводят по спиртам и заключают в канадский бальзам. В результате окраски соединительная ткань приобретает сероватый цвет, слизистое вещество — синий, мышечная ткань — оранжевый цвет, ядра клеток — желтовато-красный.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: