Для ферментации пенициллина обычно употребляют среды, в состав которых входят кукурузный экстракт, глюкоза или гидрол, лактоза или ее технический полуфабрикат в виде сиропа.
Из минеральных компонентов в среды вводят соли аммония, тиосульфат, фосфаты калия или натрия, сернокислые соли магния, марганца, цинка, натрия, меди. Для регулирования pH в ходе ферментации в среду вносят углекислый кальций. Помимо указанных компонентов, для направленного биосинтеза пенициллина с определенным радикалом в состав среды вводят предшественник. Для достижения требуемой величины pH перед началом ферментации добавляют концентрированные растворы едкого натра или фосфорной кислоты. Концентрации компонентов среды не являются строго стандартными, они зависят от штамма и условий ферментации, в первую очередь от условий аэрации. Для практической деятельности они определяются регламентом, принятым на заводе.
Среда для ферментации отличается от среды для получения посевного материала. Основным отличием посевной среды от среды для ферментации является отсутствие или меньшее процентное содержание лактозы, некоторых минеральных компонентов и предшественников. Синтетические среды, в которых используются только химически чистые компоненты и отсутствуют продукты растительного и животного происхождения, в промышленности не используются. Они представляют интерес только для исследовательских целей при изучении некоторых вопросов метаболизма продуцентов.
Ферментация пенициллина является типичным двухфазным процессом микробиологического синтеза. В первой фазе происходит интенсивное использование глюкозы и присутствующей в кукурузном экстракте молочной кислоты и медленное использование лактозы. Быстро ассимилируется азот минеральных и органических соединений среды. Количество мицелия быстро возрастает, достигая величины, близкой к максимуму его содержания. К концу первой фазы в культуральной жидкости накапливается аммиачный азот и pH повышается почти до нейтрального значения.
Во второй фазе происходит интенсивный синтез пенициллина, сопровождающийся потреблением лактозы и аммиачного азота. Скорость роста мицелия в этой фазе низкая, pH удерживается вначале на одном уровне, близком к нейтральному значению, в конце медленно повышается.
В конце второй фазы вес мицелия и содержание в нем азота понижаются, наступает автолиз. Выделение аммиака в среду вызывает сдвиг pH в щелочную зону. В щелочной среде пенициллин неустойчив, его концентрация в культуральной жидкости начинает понижаться. По состоянию мицелия, содержанию пенициллина, количеству оставшихся неиспользованными углеводов (по редуцирующим сахарам), величине pH судят о возможности передачи культуральной жидкости на фильтрацию для получения нативного раствора. При ферментации необходимо строго следить за технологическими показателями процесса.
Углеводы ферментационной среды. Поскольку наиболее благоприятным условием для образования пенициллина является быстрый рост мицелия в первой фазе ферментации с последующим его замедлением, необходимо иметь такую композицию среды, которая обеспечила бы указанные условия. Как было сказано выше, из углеводов в состав среды обычно входят глюкоза и лактоза. Глюкоза легко окисляется и потребляется грибом раньше, чем лактоза. Параллельно с глюкозой используется молочная кислота кукурузного экстракта. Существенным преимуществом лактозы является ее медленное потребление. При этом накопление органических кислот практически не происходит, так как они тотчас потребляются грибом после своего появления, будучи более доступными, чем лактоза. Медленное использование лактозы и утилизация органических кислот создают также стабильные условия pH, наиболее благоприятные для биосинтеза пенициллина. Для установления оптимальных отношений между лактозой и глюкозой были проведены опыты с различными их количествами в среде.
В исследованиях, приведенных Л. М. Лурье и М. М. Левитовым (1963) с различными культурами Pen. chrysogenum, было показано, что штаммы № 194 и 369 утилизируют лактозу без предварительного периода адаптации, в то время как штамм № 136 требует значительного инкубационного периода. Медленная усвояемость лактозы различными штаммами может быть связана либо с постепенным расщеплением ее на моносахара, либо с медленным окислением до лактобионовой кислоты. Исследуя потребление углеводов с помощью хроматографического метода, удалось обнаружить (в случае плохого роста гриба) накопление в культуральной жидкости глюкозы и галактозы. При наличии в среде только одного углевода — глюкозы все три указанных выше штамма окисляют ее очень быстро, в результате чего мицелий, лишенный источника углеводного питания, рано автолизируется, фаза биосинтеза антибиотика сокращается и уровень пенициллина падает.
Таким образом, интенсивность биосинтеза пенициллина зависит от скорости потребления углеводов. В связи с этим было сделано предположение о том, что высокие выходы антибиотика могут быть получены при непрерывном добавлении легкоокисляемых углеводов в среды или при использовании любого источника углеродного питания при условии медленной утилизации его грибом.
Было показано, что только при добавлении глюкозы со скоростью, равной примерно скорости потребления лактозы (0,022—0,045% в час), удается достичь высокого уровня образования пенициллина. Аналогичные результаты были получены при непрерывном добавлении других легкоокисляемых сахаров: галактозы, сахарозы, крахмала, ксилозы, а также гидрола.
Азотсодержащие компоненты ферментационной среды. Азот аминокислот, пептонов, белков, а также азот минеральных соединений в виде аммиака и нитратов могут легко утилизироваться для роста и биосинтеза пенициллина Penicillium chrysogenum. Аммиак ассимилируется наиболее быстро, что видно из быстрого падения содержания аммиачного азота в питательной среде. Значительная часть азота, усвоенного плесневыми грибами, представляет собой аммиачный азот, образующийся во время ферментации при дезаминировании аминокислот кукурузного экстракта. Наблюдаемое вначале увеличение содержания аммиачного азота происходит вследствие быстрого гидролиза белков и пептидов кукурузного экстракта до аминокислот и их интенсивного дезаминирования. За этим следует очень быстрое, снижение количества аммиачного азота в среде, продолжающееся до начала автолиза. Азот нитратов, очевидно, используется тогда, когда нет органических соединений азота. Интенсивность использования аммиака зависит от присутствующего в среде углевода. В случае глюкозы, сахарозы или другого усвояемого углевода аммиак используется более интенсивно, чем в присутствии лактозы.
Применяемый в настоящее время и наиболее распространенный применительно к биосинтезу пенициллина кукурузный экстракт, как основной азотсодержащий компонент среды, с успехом может быть заменен некоторыми другими веществами. К их числу относится, например, арахисовая мука. При изучении мутантов штамма Penicillium chrysogenum G-165 25% культур синтезировали больше антибиотика на среде, содержащей кукурузный экстракт, а 65% на среде с арахисовой мукой.
Может быть рекомендовано применение хлопкового и подсолнечного жмыхов, а также солодового-росткового экстракта и экстракта из хлопковых жмыхов.
Метаболизм серы. Изучение метаболизма серы и ее соединений у продуцентов антибиотиков носит крайне ограниченный характер. Для культивирования многих микроорганизмов в качестве источника серы применяют сульфаты, большей частью аммония, калия или натрия. Они обеспечивают синтез многих содержащих серу органических компонентов клетки: аминокислот (метионина и цистина), витаминов (биотина и тиамина) и т. д. Для биосинтеза молекулы пенициллина более предпочтительными оказываются соединения, содержащие серу в восстановленной форме или в лабильно связанном состоянии.
В опытах с «мечеными» соединениями серы проводилось изучение количества включенной серы в молекулу пенициллина из L-цистина и сульфата. Было установлено, что при одновременном присутствии в среде цистина и сульфата сера аминокислоты включалась в молекулу пенициллина намного интенсивнее, чем из сульфата. Однако применение аминокислот в производственных целях экономически невыгодно. В питательные среды вводят тиосульфат натрия, где один из атомов серы весьма подвижен. Введение тиосульфата в среду с кукурузным экстрактом может способствовать повышению выходя пенициллина почти в 2 раза. Количество серы, необходимое для обеспечения биосинтеза пенициллина, и количество серы, потребное для роста продуцента, неодинаково. Обычно применяемые среды содержат некоторый избыток серы.
Механизм превращений серы из окисленной неорганических соединений в восстановленную органических соединений достоверно не установлен. Арнштейн (1954) предполагает, что этот процесс складывается из следующих этапов:
Сульфат → сульфит → тиосульфат → цистеин
При использовании тиосульфата в качестве единственного источника серы в среде внутри клетки сера содержится в виде сульфата и органического соединения серы. Высокоактивные штаммы оказываются способными аккумулировать в клетке значительные концентрации серы, превышающие внеклеточные.
Цистеин за счет своей сульфгидрильной группы имеет также большое значение как восстанавливающий агент. Цистеин в живой клетке очень легко превращается в цистин и наоборот.
Изменения pH культуральной жидкости. Изменения величины pH в процессе биосинтеза происходят по общим для большинства ферментаций закономерностям. Закисление среды может происходить вследствие следующих причин: интенсивное окисление углеводов и образование органических кислот; интенсивное использование катионов (особенно аммиака). Защелачивание среды — интенсивное накопление аммиака вследствие дезаминирования аминокислот; интенсивное использование анионов, например органических кислот. При хорошо сбалансированных средах, при правильно подобранных соотношениях N: С pH культуральной жидкости соответствует тому интервалу величин, при которых биосинтез антибиотика идет наиболее интенсивно.