Факультет

Студентам

Посетителям

Направленная ферментация хлортетрациклина, тетрациклина и деметилхлортетрациклина

В состав сред при биосинтезе хлортетрациклина и тетрациклина обычно входят широко применяемые в антибиотической промышленности продукты растительного происхождения: кукурузный экстракт, арахисовые и подсолнечные жмыхи, арахисовая мука, картофель, отходы крахмального производства из картофеля и т. п.

Из углеводов наиболее благоприятными являются медленно потребляемые вещества, такие, как крахмал, сахароза. При использовании углеводов, например глюкозы, жизненный цикл актиномицетов сокращается и антибиотика образуется мало. Введение в среду крахмала может ограничиваться в связи с угнетающим действием некоторых антибиотиков на активность α-амилазы. Хлортетрациклин и тетрациклин тормозящего влияния на активность α-амилазы не оказывают. Крахмал может быть признан одним из лучших источников углевода при биосинтезе тетрациклиновых антибиотиков. В опытах с меченым (С14) крахмалом было показано, что 80—90% атомов углерода хлортетрациклина происходит из крахмала.

В качестве пеногасителей могут использоваться подсолнечное, арахисовое, кукурузное, соевое, хлопковое масла и кашалотовый жир. Введение масел при получении тетрациклиновых антибиотиков должно быть ограничено известными, установленными опытным путем, пределами. Последнее объясняется тем, что в случае, если скорость разложения масла актиномицетом будет превышать скорость утилизации его составных частей, то накапливающиеся при этом непредельные жирные кислоты отрицательно влияют на биосинтез антибиотика.

Как уже отмечалось выше, одним из необходимых компонентов среды при получении хлортетрациклина является роданистый бензил. Роданистый бензил способствует направленному ходу реакций метаболизма глюкозы по пентозному циклу. З. Гоштялек (1964) рассматривает значение пентозного цикла в биосинтезе тетрациклинов в связи с ацетатной теорией образования циклических структур. Некоторые реакции пентозного цикла идут при участии никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфата (НАДФ), восстанавливая его. Реакции, происходящие посредством конденсации ацетилкоэнзима А (после декарбоксилирования малонилкоэнзима А), требуют НАДФ в восстановленной форме. Эта восстановленная форма, как следует из сказанного, обеспечивается за счет деятельности пентозного цикла.

Di Marco (1959) считает, что большое значение могут оказать вводимые в состав среды катионы. Последние связывают синтезированный антибиотик, и он не оказывает, таким образом, отрицательного влияния на процессы дыхания. Угнетающее действие на биомассу хлортетрациклина оказывают ионы железа, вследствие образования комплекса (Fe-антибиотик), который вступает в связь с клетками мицелия актиномицета.

Анализ биохимических изменений культуральной жидкости при биосинтезе хлортетрациклина был проведен Doskocil и др. (1959) на среде, состоящей из сахарозы — 2%, кукурузного экстракта — 0,24% (технический вес), соевой муки — 2%, (NH4)2SO4 — 0,5%, СаСО3 — 0,4%, NaCl — 0,5%, мелассы — 0,2%. Было показано, что в первые десять часов ферментации происходит полное исчезновение из среды неорганического фосфата и интенсивное нарастание пировиноградной кислоты. Использование сахарозы, аммонийного азота и молочной кислоты происходит весьма незначительно. Антибиотик не синтезируется. В течение первых десяти часов синтезируются нуклеиновые кислоты, причем в последующее время ферментации их количество сохраняется примерно на одном уровне. Максимум РНК отмечается в десятичасовой культуре, после чего ее количество несколько уменьшается, количество ДНК медленно и незначительно увеличивается. Абсолютные количества обоих нуклеиновых кислот зависят от содержания в среде фосфатов. Более высоким концентрациям фосфора соответствуют большие количества нуклеиновых кислот.

В период времени после 10 ч и до 50 ч отмечалось интенсивное использование сахарозы и аммонийного азота, быстрое потребление образовавшейся ранее пировиноградной кислоты и отсутствие в среде неорганического фосфата. Биосинтез хлортетрациклина отмечался тогда, когда количество сахарозы и аммонийного азота среды были минимальными. В этот период происходило интенсивное накопление биомассы. В процессе ферментации pH среды несколько снижается (от 6,8 до 6,1—6,3), затем вновь достигает величины 6,6—6,8, повышаясь при автолизе до 7,0—7,5.

Представленные данные биохимического анализа процесса биосинтеза хлортетрациклина показывают, что он имеет двухфазный характер.

Характеристика процесса ферментации в значительной степени зависит от штамма. Так, при сравнительном изучении продуцентов хлортетрациклина Act. aureofaciens ЛСБ-2201 и ЛСБ-16 было показано, что продолжительность ферментации у них различна. Штамм ЛСБ-2201 синтезирует антибиотик при более узком интервале содержания фосфора (45—90 мкг/мл), тогда как для исходной культуры ЛСБ-16 этот диапазон более широк (14—150 мкг/мл). Больший выход хлортетрациклина у штамма ЛСБ-2201 связан с менее интенсивным потреблением питательных веществ среды и способностью синтезировать антибиотик в течение более продолжительного времени.

В процессе ферментации хлортетрациклина в культуральной жидкости Act. aureofaciens обнаруживаются вещества, близкие по химической природе к синтезируемому антибиотику. К таким веществам относятся изоформы и эпимеры тетрациклинов. Исследуя этот вопрос, В. Г. Макаревич и Т. Н. Лазникова (1963) установили, что тетрациклиновые антибиотики подвержены обратимой изомеризации по С4, в ходе которой образуются новые вещества — кватримицины. Кватримицины называют также 4-эпитетрациклинами. По сравнению с исходными веществами они обладают меньшей антибиотической активностью. Процесс эпимеризации стимулируется анионами муравьиной, уксусной, фосфорной и лимонной кислот. Наиболее благоприятное для эпимеризации значение pH лежит в пределах 2,0—6,0. При более низких и более высоких значениях pH эпимеризация сильно замедляется. Образование кватримицина ингибируется солями кальция или магния при pH 6,0.

Биосинтез изоформ хлортетрациклина и тетрациклина стимулируется при ухудшении аэрации культуры или при увеличении фосфатов. При этом синтез антибиотиков понижается.

7-Хлор-6-деметилтетрациклин и 6-деметилтетрациклин. Лишенные метильных групп у шестого углеродного атома молекулы хлортетрациклина и тетрациклина имеют иные свойства, чем исходные вещества. Они устойчивы к действию кислот и щелочей, менее токсичны и дольше сохраняются в организме человека. Образование 6-деметилтетрациклинов является результатом нарушения этапа метилирования в биосинтезе тетрациклинов. В процессе метилирования участвует парааминобензойная кислота, последняя входит в систему, «ответственную» за процессы переноса метальных групп от одних соединений к другим. Поэтому, если в питательную среду ввести сульфаниламиды, являющиеся антагонистами парааминобензойной кислоты, то процесс метилирования нарушается. В реакции переноса метальных групп принимает участие тетрагидрофолат, представляющая собой фолиевую кислоту, птеридиновое ядро которой восстановлено до тетрагидроформы. Парааминобензойная кислота, как известно, входит в состав тетрагидрофолата.

Предложено два способа получения деметилированных тетрациклинов: путем введения в среду сульфаниламидов и при помощи мутантных штаммов. Мутанты Act. aureofaciens, синтезирующие 6-деметилхлортетрациклин, характеризуются высокой устойчивостью к сульфаниламидам и дефицитом по парааминобензойной кислоте. В случае ее введения в среду синтез деметилхлортетрациклина был подавлен.

При использовании сульфаниламидов в качестве компонентов среды лучшим признан сульфагуанидин, в концентрациях 0,3—1,0 г/л. Все изученные сульфаниламиды угнетали рост и снижали общий выход антибиотика в 6—10 раз. На долю 6-деметилхлортетрациклина при этом приходилось до 65%. т. е. полной блокады метилирования не отмечалось. Введение сульфаниламидов рекомендовано в начале процесса ферментации или в первые часы, иначе образования безметильных тетрациклинов может не быть. Конкурентность действия ингибиторов доказана при введении в среду, содержащую сульфаниламиды парааминобензойной кислоты. В результате ее введения улучшался рост продуцента, увеличивался общий выход антибиотиков, происходил синтез в основном хлортетрациклина. Частичное действие сульфамидов снималось добавлением метионина, донатора метальных групп.

Механизм хлорирования тетрациклинового ядра. Как известно, тетрациклин отличается от хлортетрациклина отсутствием хлора у седьмого углеродного атома. Впервые тетрациклин был получен путем каталитического дехлорирования хлортетрациклина. Этот способ в течение нескольких лет был единственным промышленным способом получения тетрациклина. Для направленного синтеза хлортетрациклина неизменными компонентами среды должны быть соединения, содержащие хлор. Поэтому при биосинтезе хлортетрациклина существенно необходимым компонентом является поваренная соль.

Для получения тетрациклина ион хлора оказывается вредным, так как в его присутствии будет преимущественно синтезироваться хлортетрациклин. В связи с этим были предложены различные методы дехлорирования питательной среды. В частности, для осаждения ионов хлора можно использовать соли серебра. Однако этот метод слишком дорог, кроме того, требуется последующая тщательная очистка от серебра, так как микроколичества его могут оказывать угнетающее действие на развитие культуры продуцента. Поскольку следы хлора присутствуют в используемых для биосинтеза реактивах, кукурузном экстракте и т. д., в питательную среду для биосинтеза тетрациклина вводится конкурентный хлору ион брома.

Ион брома препятствует включению хлора в тетрациклиновое ядро. В среды обычно вводят бромистые соли калия или натрия. Введение бромидов должно быть в строго определенных концентрациях, так как высокое их содержание в среде может привести к включению брома в тетрациклиновое ядро и образованию бромтетрациклина.

Введение в среды солей других галогенов — фтористого натрия и йодистого калия было менее эффективным, чем введение бромистого натрия. Интенсивность конкурентного торможения отмечалась в такой последовательности Bг>F>J.

При введении в среду бромидов все же не удается получить стопроцентный выход тетрациклина. Около 10% продукта приходится на хлортетрациклин. Для получения 98—100% выхода тетрациклина в среду, содержащую бромистый натрий, рекомендуется дополнительно вводить 2-меркаптобензотиазол, тиомочевину и 2-тиоурацил. Некоторые из них, например 2-меркаптобензотиазол, могут быть введены в среду, где отсутствует бромистый натрий. Возможно, что наличие у них сульфгидрильной группы, стимулирующей окислительно-восстановительные реакции, обеспечивает окисление иона хлора в среде еще до вовлечения его в молекулу антибиотика. Т. е. ион хлора оказывается в таком новом химическом соединении, которое лишает его возможности хлорировать определенный полупродукт синтеза. Возможно также, что тиосоединения связывают медь, являющуюся составной частью полифенолоксидазных ферментов, участвующих в процессе хлорирования.

Мицелий, выращенный на среде, содержащей ингибитор, а затем отмытый и пересаженный на другую среду без ингибитора, продолжает синтезировать тетрациклин.

Специальному изучению подвергался вопрос об этапе биосинтеза, на котором происходит включение атома хлора в молекулу. Было установлено, что тетрациклин не может подвергаться ферментативному галоидированию: атом хлора в полную молекулу тетрациклина не входит. По всей вероятности, хлорирование происходит на одном из ранних этапов биосинтеза.

Соотношение образующихся в процессе биосинтеза хлортетрациклина и тетрациклина зависит от целого ряда обстоятельств, относящихся к наследственным особенностям штамма-продуцента и к условиям ведения процесса ферментации. Act. aureofaciens 2201 при культивировании в лабораторных условиях на различных ферментационных средах даже в присутствии оптимального количества хлористого натрия оказывается способным, наряду с хлортетрациклином, образовывать до 20% тетрациклина. При этом чем выше общий уровень активности, тем меньше образуется тетрациклина.

Источником хлора может быть кукурузный экстракт, поэтому по мере увеличения его содержания в средах для ферментации тетрациклина количество сопутствующего хлортетрациклина может возрастать.

Для направленного биосинтеза хлортетрациклина рекомендуется вносить хлористый натрий в начале ферментации.

Описаны мутантные культуры, у которых наследственно нарушен механизм хлорирования. Они способны вырабатывать значительные количества тетрациклина в присутствии хлористого натрия.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: