Для изучения механизма биосинтеза пенициллина используют соединения, имеющие в своем составе «меченые» соединения, содержащие С14, N15, S35.
Эти вещества вводят в среду для культивирования, затем пенициллин извлекают из среды, кристаллизуют, подвергают гидролизу и в «осколках» молекулы определяют радиоактивность. Особый интерес представляет изучение влияния на биосинтез аминокислот, так как при кислотном гидролизе, например, образуется β, β-диметилцистеин. В питательную среду вводили «меченый» цистин. Цистин в живом организме находится в подвижном обратимом состоянии с цистеином.
«Мечеными» были атомы углерода цистина в β-положении и азот. Исходя из структуры молекулы пенициллина, можно было предполагать, что цистин составит основу тиазолидинового кольца, после его восстановления до цистеина. Однако меченый азот в тиазолидиновой части молекулы не обнаруживался. Таким образом, цистеин включается в молекулу пенициллина, обеспечивая синтез, отмеченной пунктиром части молекулы:
Другой аминокислотой, которая образует структуру тиазолидиновой части молекулы, является валин. Из двух изомеров валина L-форма способствует, а D-форма тормозит биосинтез пенициллина.
В ходе дальнейших исследований промежуточных продуктов биосинтеза пенициллина, выполненных в основном Арнштейном и сотрудниками (1954, 1956), из мицелия Pen. chrysogenum был выделен трипептид, состоящий из цистеина, валина и α-аминоадипиновой кислоты. Причем в случае его циклизации порядок расположения аминокислот в нем допускает возможность образования синнематина В, т. е. пенициллина, боковой радикал которого образован остатком α-аминоадипиновой кислоты.
В другой работе этой же серии было показано, что при добавлении в среду меченого дипетида цистеинил-валина гриб использует его для построения пенициллинового ядра без предварительного расщепления пептидной связи.
На основании этих данных, а также учитывая то обстоятельство, что качество трипептида, найденное в мицелии гриба, вполне сравнимо с внутриклеточной концентрацией пенициллина, было сделано заключение, что образующийся в мицелии дипептид в результате реакции транспептидации превращается в трипептид, который затем подвергается конденсации с образованием системы пенициллинового кольца. Вопрос о том, на какой ступени биосинтеза происходит отщепление или замена остатка α-аминоадипиновой кислоты на соответствующий синтезируемому пенициллину боковой радикал, в настоящее время еще не ясен. Некоторые исследователи высказывают мнение, согласно которому первоначально, в результате циклизации трипептида, образуется синнематин В, а затем происходит замещение его бокового радикала соответствующими карбоновыми кислотами.
Полагают, что боковой радикал присоединяется к основной части молекулы после циклизации трипептида и отщепления α-аминоадипиновой кислоты.
По теории, предложенной Ганапати (1957), радикал присоединяется к молекуле цистеина на одной из ранних стадий биосинтеза. Что касается молекулы валина, то в соответствии с этой теорией она предварительно дезаминируется с образованием диметилпировиноградной кислоты, которая вступает в реакцию в своей энольной форме.
Донатором аминной группы при этом является неизвестный продукт. В последнее время предложенная выше теория Арнштейна имеет больше сторонников, чем теория Ганапати.
Из других «меченых» соединений, которые изучались как потенциальные полупродукты биосинтеза молекулы пенициллина, большое значение имеют органические кислоты. Как было сказано выше, в состав молекулы пенициллина входят различные радикалы.
Для того, чтобы был синтезирован пенициллин определенного типа, содержащий требуемый радикал, в среду вводят соединения, очень близкие по структуре к радикалу. Такие соединения, которые полностью или с незначительными изменениями входят из питательной среды в молекулу антибиотика, называют предшественниками.
Для получения бензилпенициллина в среду для ферментации обычно вводят фенилуксусную кислоту или фенилацетамид. При биосинтезе феноксиметил-пенициллина предшественником боковой цепи молекулы могут быть β-феноксиэтанол и феноксиуксусная кислота.
Предшественники значительно стимулируют общий выход пенициллина. Например, один из мутантов Penicillium chrysogenum, образующий в отсутствие предшественника 2500 EД/мл различных пенициллинов и пенициллиноподобных веществ, при культивировании его на среде с фенилуксусной кислотой способен синтезировать до 8000 ЕД/мл бензилпенициллина, без примеси других пенициллинов.
В настоящее время показана возможность энзиматического превращения бензилпенициллина в феноксиметилпенициллин и обратно с использованием бесклеточного экстракта из мицелия продуцента пенициллина.