Факультет

Студентам

Посетителям

Другие фракции клейковины пшеницы

Глиадин и глютенин могут быть выделены из клейковины лишь в строго определенных условиях. Многочисленными работами установлено, что резко очерченных границ между ними не существует и, изменяя методику выделения, можно из одной и той же клейковины получать то большие, то меньшие количества одной из этих фракций, за счет соответственного изменения количества другой. Например, при экстрагировании клейковины или муки горячим 70%-ным спиртом.

Количество глиадина заметно увеличивается (Sharp, Herrington, 1927; Blish, 1927), причем показано, что при этом происходит не более полное, чем в обычных условиях, извлечение глиадина, но в спиртовой раствор частично переходит глютениновая фракция клейковины (Blish, Sandstedt, 1929). Это подтвержу дается также опытами с очищенными препаратами глютенина, 26% азота которого удается извлечь кипящим 70%-ным спиртом. Таким образом, в известных условиях фракция, обычно относимая к глютенииу, может частично учитываться как глиадин, и наоборот.

Вообще нужно сказать, что разделение клейковины на две части — глиадин и глютенин — весьма произвольно, так как, изменив методику фракционирования, можно получить ряд других фракций, заметно отличающихся как от глиадина, так и от глютенина. Еще в старых работах Гортнера и его сотрудников (Гортнер, 1933; Gortner Hoffman, Sinclair, 1929; Sinclair, Gortner, 1933; Rich, 1936, 1938) было показано, что солевые растворы могут извлекать из муки не только альбумины и глобулины, но и значительную часть «клейковинных белков». Так, например, в нормальный раствор йодистого калия переходит до 64% от общего азота муки, что в пересчете на азот альбуминов и глобулинов, определяемый стандартной методикой, составляет 340% и это указывает на значительную пептизацию клейковины дополнительно к неклейковинным белкам. Прямыми опытами было показано (Sinclair, Gortner, 1933), что препараты глиадина способны пептизироваться некоторыми солевыми растворами. Например, нормальный раствор бромистого калия пештизировал около 30%, а нормальный раствор йодистого калия — до 76% от всего количества взятого глиадина.

Крейси и Сведберг (Krejci, Svedberg1, 1935) выделили ряд белковых фракций, экстрагируя пшеничную муку растворами солей галоидов в различной последовательности и очищая затем солевые экстракты путем переосаждения белков сульфатом аммония и диализа. Измерения молекулярных весов полученных фракций, проведенные методом ультрацентрифугирования, показали, что последние не являются гомогенными и несомненно включают в себя не только глобулины и альбумины, но и Значительную часть клейковинных белков, которые, однако, распределившись по выделенным фракциям полностью утратили свою индивидуальность в том отношении, что ни одна из этих фракций не идентична ни глиадину, ни глютенину. Таким образом, белок клейковины в указанных опытах был разделен иначе, чем при последовательном экстрагировании его спиртом и щелочью, когда получаются две фракции — глиадин и глютенин.

Разделение клейковины на фракции, отличные от глиадина и глютенина, возможно также с помощью методики, предложенной Куком и Алсбергом (Cook, 1931; Cook, Alsberg, 1931). Указанные авторы стремились получить глиадин, и особенно глютенин, по возможности в нативном виде, для чего требовалось избежать применения спирта, щелочи или кислоты, заметно денатурирующих глютенин в процессе его выделения. С этой целью они диспергировали сырую клейковину в 30%-ном водном растворе мочевины, которая хотя и денатурирует белки (Hopkins, 1930; Burk, Greenberg, 1930; Burk, 1937, 1938), но, по-видимому, значительно слабее, чем щелочь или кислота. Дисперсия клейковины очищалась в суперцентрифуге от крахмала и затем глютенин осторожно высаливался сернокислым магнием, добавляемым до 0,18 от насыщения. Дальнейшее добавление сернокислого магния приводило к высаливанию глиадина. Как упоминалось выше, полученные таким образом препараты глиадина и глютенина заметно отличаются от аналогичных белков, выделяемых по Осборну или по Блишу и Сандстедту. Наиболее же интересным является тот факт, что, увеличивая постепенно количество сернокислого магния, добавляемого к дисперсии клейковины в растворе мочевины, можно получить любое число белковых фракций, заметно отличающихся по своему составу и свойствам как от глиадина, так и от глютенина. В опытах Кука было получено 6 таких фракций, причем автор рассматривал их как смеси различных количеств глиадина и глютенина. Однако подобное объяснение кажется мало убедительным, так как при наличии в клейковине двух резко отличающихся по растворимости фракций осаждение их не могло бы иметь столь постепенного и плавного характера, как это наблюдается в действительности. Нам кажется, что описанные опыты подтверждают мысль о возможности разделения клейковинного белка по иным связям, чем в случае выделения глиадина и глютенина.

Следующий способ фракционирования клейковины был предложен Сандстедтом и Блишем (Sandstedt, Blish, 1933; Blish, 1945), а затем применялся с некоторыми видоизменениями и другими авторами (Harris, Bailey, 1937; Stockelbach, Bailey, 1938). Сырая клейковина диспергируется в 0,05—0,1 п уксусной кислоте, добавляется небольшое количество сернокислого калия (или другой соли) и этиловый спирт до концентрации. 50% по объему. При постепенном охлаждени. раствора происходит выделение ряда белковых фракций, количество и характер которых очень сильно меняются в зависимости от применяемой методики. Достаточно, например, заменить сернокислый калий хлористым натрием, этиловый спирт метиловым, или изменить последовательность прибавления к дисперсии соли и спирта, чтобы получить большое разнообразие фракций, различающихся по своей растворимости и выпадающих в осадок то при одной, то при другой температуре. С большой степенью условности все эти фракции объединяют по признаку постепенного возрастания их растворимости в три большие группы: глютенин, мезонин и глиадин. При использовании сернокислого калия и этилового спирта глютенин выделяется из раствора при температуре 18—20° и составляет 20—35% от всей клейковины, мезонин оседает при 10—14° и составляет 15—25%, и, наконец, глиадин может быть выделен при охлаждении до 4° и ниже, причем количество его колеблется около 50% от веса клейковины. Условность подобной классификации подтверждается большими колебаниями соотношения трех указанных фракций в клейковине из различных сортов пшеницы (Harris, Baiiey, 1937). В то же время показано, что по аминокислотному составу глютенин и мезонин, полученные из одной и той же клейковины, заметно отличаются друг от друга.

Таким образом, описанный способ фракционирования клейковины подтверждает возможность разделения ее на составные части, отличные от тех, которые получаются при использовании других методов и в частности общепринятой методики разделения клейковины на глиадин и глютенин.

Весьма интересные результаты были получены при фракционировании клейковины из ее дисперсий в водном растворе салицилата натрия.

В главе о растворимости клейковины мы подробно рассмотрим свойства ее салициловых дисперсий, а здесь остановимся лишь на характеристике белковых фракций, получаемых из клейковины с помощью салицилата.

Известно, что сырая клейковина может быть полностью диспергирована в 10—12%-ном водном растворе салицилата натрия без значительного изменения ее первоначальных физических свойств (Cook, Rose, 1934; Княгиничев и Горелкина, 1937). Простое разбавление водой, диализ или высаливание приводят к осаждению клейковины из салициловой дисперсии в виде связной, эластичной и упругой массы, подобной первоначальной сырой клейковине.

Специальными опытами было установлено, что салицилат натрия денатурирует клейковинные белки значительно слабее, чем щелочь, уксусная кислота и мочевина, вследствие чего в настоящее время водный раствор салицилата следует признать наиболее «мягким» средством для растворения клейковины (Rose, Cook, 1935; Cook, Rose, 1935a, 6).

Если к дисперсии клейковины в растворе салицилата натрия прибавлять возрастающие количества сернокислого магния, то происходит постепенное осаждение клейковинных белков в виде ряда фракций, различающихся между собой не только по растворимости, но и по аминокислотному составу, в частности по содержанию амидного азота и аргинина (McCalla, Rose, 1935).

Ни одна из этих фракций внешне не похожа на клейковину, однако при повторном диспергировании каждой из них в 10%-ном растворе салицилата натрия, смешивании всех дисперсий и высаливании суммарного белка из смеси сернокислым магнием получается осадок, очень похожий на свежеотмытую сырую клейковину. Таким образом, процесс фракционирования клейковины из салициловой дисперсии является обратимым.

В дальнейшем было показано, что разделение клейковины на фракции можно осуществить не только путем постепенного осаждения ее салициловой дисперсии сернокислым магнием, но и путем последовательного растворения сырой клейковины водными растворами салицилата натрия возрастающих концентраций (от 2 до 8%) (Spencer, McCalla, 1938). Кривая распределения амидного азота по этим фракциям в зависимости от их растворимости почти точно совпадаете аналогичной кривой; для фракций, полученных методом осаждения. Ни одна из фракций не идентична ни глиадину, ни глютенину.

Для выяснения вопроса об однородности белкового комплекса клейковйны Мак-Колла и Грален (McCalla, Gralen, 1940, 1942) разделили его на ряд фракций путем высаливания салициловой дисперсии клейковины сернокислым магнием, а также с помощью постепенного разбавления исходной дисперсии водой. Каждую фракцию вновь растворяли в 12%- ном салинилате натрия и затем определяли ее молекулярный вес м диффузионную константу методом ультрацентрифугирования. Результаты измерений привели авторов к выводу о том, что клейковина является в высшей степени гетерогенной системой. Молекулярные веса полученных фракций колебались от 1 750 000 до 43 000, причем по характеру диффузионных кривых было видно, что каждая фракция в свою очередь также не гомогенна. Отдельные фракции различаются между собой по форме белковых молекул, которые в общем являются, по-видимому, тонкими и удлиненными, причем дисимметрия их увеличивается с уменьшением растворимости фракций. Если добавить к этому, что, согласно многочисленным работам Гарриса и его сотрудников (Harris, 1937, 1938, 1939; Harris, Johnson, 1939, 1940), количественное соотношение фракций, осаждаемых сернокислым магнием из салициловой дисперсии клейковины, весьма непостоянно и меняется в зависимости от исходного качества клейковины, а также природы и активности протеолитических ферментов муки, то все многообразие возможного расчленения клейковинного белка вырисовывается с достаточной полнотой.

Подводя итоги всему изложенному о различных способах фракционирования клейковины, можно прийти к следующим выводам. Разделение клейковинного белка на две фракции — глиадин и глютенин — является наиболее распространенным, но далеко не единственно возможным способом изучения составных частей клейковины. Применяя другие методы, клейковину удается разделить на ряд иных фракций; заметно отличающихся друг от друга по составу и свойствам и не идентичных ни глиадину, ни глютенину. Эти факты имеют первостепенное значение для создания правильных представлений о химическом строении клейковины как сложной коллоидной системы белкового характера.

Выделение белков пшеницы фракционированием муки по удельному весу

Все описанные выше методы получения и очистки отдельных белковых фракций клейковины не позволяют выделить клейковинный белок целиком без разделения его на составные части и по возможности в том же состоянии, в каком он находится в эндосперме пшеничного зерна.- До недавнего времени существовал только один способ выделения клейковины целиком — отмывание ее из пшеничной муки. Этот способ, однако, не является вполне удовлетворительным для исследования физико-химических свойств и структуры клейковинного белка, так как набухание последнего в воде, механическое воздействие при замесе теста и отмывании, а особенно последующее обезвоживание даже наиболее мягкими Методами всегда несколько изменяют первоначальные свойства белка, т. е. в той или иной степени денатурируют его.

В последнее время Гесс разработал оригинальный метод выделения белка пшеничной муки целиком, без разделения его на фракции и без применения водной среды (Hess, 1952, 1953, 1954, 1955, 1958). Принцип этого метода заключается в следующем. Главные составные части эндосперма пшеничного зерна — крахмал и белок — заметно отличаются друг от друга по удельному весу. По измерениям Гесса (Hess, 1953), удельный вес белка пшеницы (d*20) равен 1,317±0,001 г/мл, а крахмала — 1,4945-1,5046±0,0005 г/мл.

Если тонкоизмельченную муку суспензировать в жидкости, плотность которой выше удельного веса белка и ниже удельного веса крахмала, при обязательном условии: что оба эти вещества не способны в ней набухать, то под влиянием силы тяжести будет происходить постепенное фракционирование компонентов муки, а именно — белок всплывет на поверхность, крахмал осядет. С помощью центрифугирования этот процесс можно значительно ускорить и все разделение проводить за 10—20 минут. Наиболее подходящей средой для фракционирования по Гессу является смесь хлороформа с бензолом или с четыреххлористым углеродом удельного веса 1,38 г/мл. Обязательным является предварительное тщательное измельчение муки, например на шаровой или вибрационной мельнице; в муке обычного помола эндосперм измельчен слишком грубо, частицы крахмала и белка в значительной мере соединены в относительно большие агрегаты, представляющие собой осколки эндосперма; для фракционирования же по удельному весу необходимо по возможности разрушить механическую связь крахмала и белка, чтобы частицы их могли независимо передвигаться в жидкости, применяемой для фракционирования, в соответствии со своим удельным весом. Практически, выделение белка методом Гесса можно осуществлять в различных вариантах. Для примера опишем методику, применяемую в биохимической лаборатории Всесоюзного исследования зерна.

Пшеничную муку 70%-ного помола обезжиривают серным эфиром в аппарате Сокслета (если не требуется полного удаления жиров, то можно муку и не обезжиривать предварительно, поскольку главная масса жира будет извлечена в процессе фракционирования белка смесью хлороформа и бензола) и размалывают на шаровой мельнице в течение пяти часов. Измельченную муку помещают в центрифужные стаканы, заливают двойным количеством смеси бензола и хлороформа удельного веса 1,38 г/мл. тщательно размешивают и центрифугируют при 3000—4000 об/мин. в течение 20 минут. На поверхности центрифугата всплывает обильный слой белка. Белок и центрифугат сливают на бумажный фильтр, а осадок повторно заливают смесью хлороформа и бензола и вновь центрифугируют. Операцию разделения повторяют 3—4 раза, причем каждый раз белка всплывает все меньше и меньше. Главную массу растворителя отфильтровывают, фильтр быстро высыхает и белок получают в сухом состоянии. Осадок, состоящий в основном из крахмала, также освобождают от растворителя путем естественного испарения хлороформа и бензола.

Уже в первой своей работе Гесс показал, что фракционированием по удельному весу можно выделить из муки только около половины ее белка (44—66%), тогда как другая половина остается в осадке и прочно связана с крахмалом. Этот факт, подкрепленный исследованиями муки и зерна методами оптической и электронной микроскопии, привел Гесса и его сотрудников к следующим принципиально новым представлениям о характере белков пшеничного эндосперма (Hess, Mahl, 1954; Hess, 1954; Hess, Mahl, Gutter, Doddt, 1955; Hess, Mahl, Gutter, 1955; Hess, 1955).

На поверхности каждого крахмального зерна имеется слой белка, который очень прочно соединен с крахмалом и не отделяется от него при измельчении муки и фракционировании по удельному весу. Этот белок Гесс назвал хафтпротеином. Промежутки между крахмальными зернами плотно заполненый другим белком, так называемым цвикельпротеином. Крахмальные зерна как бы погружены в массу этого белка. При измельчении пшеничного зерна и муки частицы цвикельпротеина разламываются, отделяются от крахмала и могут быть выделены фракционированием по удельному весу в органических жидкостях, как описано выше. Хафтпротеин же остается при этом в осадке вместе с крахмалом. В русской литературе хафтпротеин называют также прикрепленным белком, а Цвикельпротеин — промежуточным белком (Козьмина, 1959).

В оптическом микроскопе цвикельпротеин имеет вид частиц угловатой формы размером от 1,5 до 20 р. (Ильина. Бутман, 1957). С помощью ультрафиолетового микроскопа В. Н. Ильина и Л. А. Бутман (1957) наблюдали в ультрафиолетовых лучах характерную голубоватую люминесценцию как частиц цикельпротенна, так и крахмальных зерен, благодаря находящемуся на их поверхности хафтпротеину. Непосредственно увидеть хафтпротеин на крахмальных зернах в оптический микроскоп нельзя. Однако если препарат крахмала с хафтпротеином обработать раствором пепсина в соляной кислоте для расщепления белка, то голубая люминисценция поверхности крахмальных зерен в ультрафиолетовом свете полностью исчезает (Ильина и Бутман, 1957). Цвикельпротеин и хафтопротеин можно также наблюдать на микроскопических препаратах муки и срезах зерна с помощью окрашивания их некоторыми красителями. Гесс и Мааль (Hess, Mahl, 1954) применяли для этого тиазолгельб, титангельб и фастгрин.

С помощью электронного микроскопа хафтпротеин удается непосредственно наблюдать на поверхности крахмальных зерен в виде волокнистого слоя, состоящего из отдельных фибрилл. Толщина каждой фибриллы составляет приблизительно 100 А, а толщина всего белкового слоя — около 0,217 р (Hess, Mahl, 1954). На рис. 6 представлен вид крахмального зерна с хафтпротеином на его поверхности в электронном микроскопе при увеличении в 11000 раз (Ильина, Бутман, 1957).

Обработка пепсином освобождает крахмальные зерна от слоя хафтпротеина. Цвикельпротеин в электронном микроскопе не обнаруживает никакой структуры (Hess. Mahl, 1954; Ильина, Бутман, 1957).

Диаметр частиц цвикельпротеина по измерениям Гесса (Hess, 1954) колеблется в пределах 6,2—12,3 р., а толщина его пластинок от 0,246 до 0,368 р.

Выше упоминалось, что для успешного отделения цвикельпротеина от крахмала и хафтпротеина большое значение имеет измельчение материала. Гесс (Hess, 1954) показал, что при фракционировании муки без дополнительного размола ее на шаровой мельнице выход цвикельпротеина составляет всего лишь 0,02—2,00% от веса взятой муки. Колебания выхода зависят от исходного качества муки. Цвикельпротеин, полученный таким способом, Гесс называет «свободным» цвикельпротеином в отличие от «общего» цвикельпротеина, извлекаемого из муки после измельчения ее на шаровой мельнице. Выход общего цвикельпротеина составляет около 6% от веса муки. Оказалось, что для полного извлечения цвикельпротеина муку нужно размалывать на шаровой мельнице в течение 14 часов. При меньшем сроке помола выход цвикельпротеина снижается, а при большем (до 29 часов) — остается постоянным. Последнее обстоятельство указывает на значительную прочность связи хафтпротеина с поверхностью крахмальных зерен, поскольку даже интенсивным размолом не удается освободить хафтпротеин и увеличить за счет этого фракцию цвикельпротеина.

Если определять выход белка при фракционировании по удельному весу в зависимости от плотности применяемой жидкости, то получается кривая (Hess, 1954).

Нижняя пунктирная линия соответствует выходу чистого цвикельпротеина, а сплошная линия — общему весовому выходу белковой фракции. При повышении плотности извлекающей смеси происходит непрерывное увеличение выхода белковой фракции (в процентах от взятой муки), однако количество чистого цвикельпротеина возрастает лишь до определенного предела, а при дальнейшем увеличении плотности жидкости происходит извлечение более тяжелых частиц, в которых белок соединен с крахмалом и которые в менее плотной среде оседают на дно. Перегиб кривой, соответствующий максимуму извлечения чистого цвикельпротеина, наблюдается, но данным Гесса, при плотности смеси, равной 1,355 г/мл. При более высокой плотности среды процент белка во фракции цвикельпротеина понижается, при более низкой плотности — повышается. Следовательно, если необходимо получить цвикельпротеин, наиболее очищенный от крахмала, то фракционирование нужно проводить в смеси, плотность которой почти равна удельному весу белка и выражается величиной около 1,32—1,33 г/мл. При этом, однако, выход очищенного цвикельпротеина будет минимальным, так как частицы белка, механически связанные с крахмалом, осядут и попадут во фракцию крахмал — хафтпротеин. Если же фракционирование проводится для получения крахмала, по возможности свободного от белка, то чтобы наиболее полно удалить частицы цвикельпротеина, необходимо применять смесь высокой плотности порядка 1,48—1,50 г/мл.

Таким образом, в зависимости от исходного материала, степени его измельчения и плотности применяемой для фракционирования смеси выход цвикельпротеина и содержание в нем чистого белка могут быть весьма различными.

Н. П. Козьмина и А. Т. Наумова (1957) провели сравнительное выделение цвикель — и хафтпротеинов из твердых пшениц со стекловидностью около 95—99% и мягких мучнистых пшениц со стекловидностью 8—12%. Мука тонко измельчалась на вибрационной мельнице и фракционировалась смесью хлороформа и бензола с плотностью 1,38 г/мл. Из стекловидного зерна было выделено 1,10—3,70% цвикельпротеина (от веса муки), что соответствовало в среднем 12% общего азота муки. Выход цвикельпротеина из мучнистых пшениц составлял 4,40—6,40% веса муки или 36,8% общего азота.

А. Б. Вакар и Е. С. Толчииская выделяли цвикельпротеин из пшеницы клейковиной различного качества. В тех случаях, когда исходная мука 70%-ного помола не подвергалась до-полнительному размельчению, выход цвикельпротеина колебался в пределах 0,47—1,02% от ее веса. Из образцов муки, размолотых на шаровой мельнице в течение 5—15 часов, цвикельпротеин выделялся в количестве 3,6—8,1%.

Из искусственной смеси крахмала с цвикельпротеином последний удается выделить количественно (Hess, 1954).

Для отделения хафтпротеина от крахмала и получения чистого препарата этого белка Гесс (Hess, 1955а, б) рекомендует обрабатывать фракцию хафтпротеин — крахмал этилен-хлоргидрином; при этом белок переходит в раствор, из которого затем осаждается с помощью серного эфира. Таким же способом можно получать в очищенном виде и препараты цвикельпротеина.

Весь ход разделения и очистки белковых веществ муки Гесс (1955, 1958) изображает в виде схемы.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: