Для определения активности альфа-амилазы в США в основном пользуются методом Вольгемута в модификации Сандстедта, Книна и Блиша. К стандартному раствору декстрина добавляется вытяжка зерна и реакция доводится до определенного момента, когда окраска испытуемого раствора йодом совпадает с определенной стандартной окраской.
Активность фермента определяется величиной, обратной времени реакции, необходимому для достижения этого момента. Для того чтобы присутствие бета-амилазы в образце не могло помешать определению альфа-амилазной активности, добавляется избыток бета-амилазы. Альфа-амилазная активность непроросшего зерна так низка, что для ее определения пользуются микрометодом с большой продолжительностью времени реакции (в течение ночи). Этот метод основан на том же принципе, что и модифицированный метод Вольгемута. В последнее время были предложены другие модификации основного метода Вольгемута. Альтернативную возможность представляет использование эритродекстрина, конечного продукта действия бета-амилазы на крахмал, в качестве субстрата для определения альфы-ами — лазной активности.
Ряд европейских исследователей весьма успешно используют вискозиметрические методы. Использование оксиэтилированного крахмала в качестве субстрата делает излишним контроль за активностью бета-амилазы, поскольку этот фермент не действует на производные крахмала. Однако приготовление этого продукта должно выполняться под строгим контролем. Для определения вязкости картофельного крахмала, взятого в качестве субстрата (рН 5,2—5,5, температура 50—52°), применяется вискозиметр Оствальда. Кроме того, пользуются методом капиллярной вискозиметрии.
Отношение декстринирующей активности, определенной методом Вольгемута, к разжижающей активности, определенной вискозиметрическими методами, не является одинаковой величиной для амилаз различного происхождения (зерновой, бактериальной или грибной). Это побудило Ландиса и Редфер на внести улучшение в вискозиметрические методы, предложив использовать в качестве субстрата клейстеризованный картофельный крахмал. Для этой же цели Померанц использовал предварительно желированный пшеничный крахмал.
Существует целый ряд автолитических методов, которые хотя и не дают возможности точно определить альфа-амилазную активность, могут быть использованы в целях контроля. Для контроля за альфа-амилазной активностью в пшеничной муке (к которой был добавлен пшеничный или ячменный солод) используют обычно амилографический метод, в который в последнее время было внесено много модификаций. Этот метод основан на нагревании до 95° водно-мучной болтушки в самопишущем вискозиметре вращения. Присутствие добавленной альфа-амилазы легко и быстро определялось по ее влиянию на снижение максимума вязкости после того, как превышалась температура клейстеризации крахмала. Действие бета-амилазы в данном случае сводилось до минимума, так как большая часть ее обычно инактивировалась при температурах, при которых наблюдается максимум вязкости.
Другим автолитическим методом, основанным на определении вязкости, является метод Хагберга, который некоторыми существенными деталями отличается от метода Брабендера. Водно — мучную болтушку (5 г муки и 25 мл воды) нагревают на кипящей водяной бане при температуре, превышающей температуру клейстеризации крахмала, до момента разжижения. В случае с пшеничной мукой клейстеризация наблюдается спустя 20—40 секунд, а разжижение — через 30—300 секунд. Затем вычисляют диастатическое число Хагберга как величину, обратную разности между временем разжижения и временем клейстеризации.
Автолитические методы могут быть основаны также на окрашивании автолизированной муки после добавления йода. Муку (5 г) экстрагируют 100 мл воды при 70° в течение 30 минут. Добавлением серной кислоты реакцию останавливают и к фильтрату экстракта добавляют раствор йода. Активность альфа-амилазы определяется по образовавшейся с йодом окраске. Тот же самый принцип использовал О л е р о д [102], который определял константу реакции путем определения интенсивности окраски обработанного йодом экстракта при длинах волн от 520 до 580 ммк. Однако кажется маловероятным, чтобы реакция, которую проводят при 30° в течение часа, могла устранить бета-амилазную активность наподобие того, как это имеет место в предыдущем методе.
Рассмотренные автолитические методы отличаются быстротой и точностью. Они незаменимы для контрольных целей и широко применяются, в частности в Европе, для определения степени прорастания, которому может подвергнуться пшеница в поле «на корню» или при хранении зерна на складе. Сами по себе эти методы непригодны для точного определения альфа-амилазной активности.