Возможность гибели клеток во время замораживания и оттаивания в результате повышения концентрации солей в среде подверглась количественной и качественной проверке на клетках самых различных типов.
За счет летального действия концентрированных растворов солей можно в известной степени отнести гибель некоторых видов бактерий после неоднократного замораживания и оттаивания, а также после консервации при температурах от 0 до —30°. Этим же объясняется защитное действие глицерина на микроорганизмы.
Однако не все явления объясняются так просто. Например, относительное число некоторых патогенных простейших, а также некоторых опухолевых клеток, переживающих медленное охлаждение до низких температур, выше, чем число этих же клеток, переживающих быстрое охлаждение до тех же температур в обычной среде, не содержащей ни глицерина, ни других защитных веществ. По-видимому, эти клетки переносят длительное воздействие концентрированных солевых растворов лучше, чем быстрое падение температуры. Клетки многослойного плоского эпителия кожи кролика переживают и быстрое и медленное охлаждение до —79°, если их быстро согревают. Клетки мальпигиевого слоя погибают при быстром охлаждении и переживают медленное при условии быстрого согревания. Следовательно, клетки кожи, по-видимому, переносят воздействие концентрированных солевых растворов. Это предположение подтверждается и тем фактом, что кожа кролика в растворе Рингера переживает лиофилизацию при температурах от —30 до —32°, пока содержание воды не снизится с 70 до 25%. Глицерин повышает выживаемость кожи после замораживания и оттаивания.
В присутствии 15% глицерина эпителиальные клетки переживают медленное оттаивание, а клетки мальпигиевого слоя — быстрое замораживание (согревание по — прежнему должно происходить быстро). Следовательно, глицерин действует не только в качестве буфера для солей. Для того чтобы объяснить все описанные явления, необходимо изучить физико-химическую структуру клеточных оболочек и те пути, посредством которых эти клетки получают повреждения.
Нервные клетки, их волокна и ганглии служат еще одним примером живой материи, для которой повышение концентрации солей не является основной причиной их повреждений во время замораживания. Паско обнаружил, что препараты верхнего шейного ганглия крысы вместе с пре — и постганглионарными волокнами переживали замораживание при —5° в уравновешенном солевом растворе Кребса, почти не утрачивая своей физиологической функции. Об этом можно было судить по проведению потенциалов действия после оттаивания. Повреждения усиливались при температурах от —5 до —15°, но и после 12 час пребывания при —15° в некоторых случаях можно было зарегистрировать потенциал действия в постганглионарном нервном волокне. При охлаждении до —79° в растворе Кребса препараты неизменно погибали. Разрушения клеток не удавалось избежать, применяя быстрое охлаждение препарата от —5 до —40° с помощью методов, предотвращающих гемолиз эритроцитов. Препараты, предварительно обработанные 15-процентным раствором глицерина, переживали охлаждение до —79° и хранение при этой температуре. После оттаивания они давали такую же реакцию, как и до замораживания. Повреждение нервных клеток и волокон, по-видимому, нельзя объяснить исключительно действием высокой концентрации солей. Очевидно, глицерин оказывает защитное действие посредством какого-то другого механизма (помимо его действия в качестве буфера для солей). Возможно, нервныё волокна, чувствительные к изменениям ионного равновесия в среде при нормальной температуре, получают необратимые повреждения в результате изменения соотношения ионов кальция и ионов натрия и калия при температурах ниже 0°, поскольку различные соли выпадают в осадок при разных температурах. Нет ничего удивительного в том, что оболочки нервных волокон, некоторые чрезвычайно богатые миелином, отличаются от оболочек эритроцитов своей устойчивостью к лиотропному действию концентрированных растворов хлористого натрия и других солей.
Мышечные волокна обладают особой чувствительностью к изменениям соотношения ионов кальция и ионов натрия и калия в окружающей их среде. Наличие в среде избытка кальция может привести к необратимой контрактуре мышц во время замораживания. Кроме того, на мышечные волокна влияют изменения pH, которые вызывают денатурацию липопротеидов в оболочках отдельных волокон, а также денатурацию миоглобина и других белков, находящихся в растворе в самих клетках.
Ридж установил, что эндотелий роговицы переносит высокие концентрации глицерина при pH 8,8 лучше, чем при pH 5,85, судя по потреблению кислорода при соответствующих условиях инкубации. Замораживание и оттаивание в отсутствие глицерина вызывало гибель клеток. При добавлении же в среду глицерина они выживали, особенно при высокой величине исходного pH.
Лавлок всегда подчеркивал, что при вымерзании воды в сложной среде повышается концентрация не только хлористого натрия и других солей, но и водородных ионов. Кроме того, на величину pH в процессе замораживания влияет выпадение в осадок менее растворимых солей буферной системы. Этому способствует присутствие хлористого натрия и других солей, концентрация которых по мере падения температуры повышается. Другой результат повышения концентрации солей заключается в том, что белки, изоэлектрическая точка которых лежит при кислом pH, становятся еще более кислыми и впоследствии могут денатурировать как в цитоплазме, так и в среде, окружающей клетки.
Во время замораживания концентрация таких веществ, как мочевина и другие конечные или промежуточные продукты обмена веществ, может повыситься до такой степени, что они станут токсичными. Этот вопрос еще не исследован. Концентрация различных лекарственных препаратов и антибиотиков также иногда достигает токсичного уровня. Например, сульфамиды, добавляемые в разбавитель бычьей спермы для предотвращения размножения бактерий, во время хранения при температуре выше 0° оказались токсичными для сперматозоидов, которых замораживали и хранили при низких температурах в среде, содержащей глицерин.
Не изучено еще действие повышенных концентраций газов в растворах с промежуточными температурами, а также влияние затвердевания СО2 при —79° и сжижения других газов при более низких температурах. Вопрос о повреждениях, вызываемых образованием пузырьков газа во время оттаивания, уже подвергался обсуждению.
Полное вымерзание воды может повлечь за собой такое тесное соприкосновение структур и составляющих их молекул, что после таяния льда они не смогут отделиться друг от друга в результате денатурации или по какой-либо иной причине. В конечном счете молекулы воды, необходимые для сохранения структурной целостности белков, могут выделяться.