В последнее время вновь наблюдается повышенный интерес к вопросу о действии замораживания и оттаивания на бактерии.
Отчасти это вызвано высоким процентом гибели культур в процессе лиофилизации и во время хранения в высушенном состоянии, а отчасти — успешным применением глицерина для консервации сперматозоидов и эритроцитов млекопитающих в замороженном состоянии при очень низких температурах. Так, например, Холлендер и Нелл нашли, что в тех случаях, когда проводили несколько циклов замораживания и оттаивания культур Escherichia coli и Streptococcus pneumoniae в бульоне, погружая их на 5 мин то в спиртовую баню, насыщенную твердой углекислотой с температурой —78°, то в водяную баню при +30°, число жизнеспособных клеток быстро сокращалось.
В культурах пневмококков число поврежденных в каждом цикле бактерий было выше, чем в культурах кишечной палочки. Когда бактерии тех же видов взвешивали в бульоне, содержащем 15% глицерина, число жизнеспособных бактерий не уменьшилось после 8 циклов замораживания и оттаивания. Rhodospirillum rubrum, по-видимому, не размножался в среде, содержащей глицерин. Подвижность отдельных микроорганизмов снижалась во взвесях в бульоне, содержащем 15% глицерина. Тем не менее глицерин предотвращал высокую смертность бактерий, которая была бы неизбежна при неоднократном замораживании и оттаивании. После 8 циклов число подвижных микроорганизмов не уменьшилось, а после перенесения их в среду, не содержащую глицерина, число живых R. rubrum было сравнимо с числом бактерий в незамороженных обработанных глицерином контрольных пробах. На основании этого было высказано предположение, что, хотя глицерин защищает микроорганизмы во время замораживания и оттаивания, продолжительное контактирование с ним вызывает разрушение. Интересно было бы узнать, можно ли избежать этого вредного влияния глицерина» постепенно удаляя его из среды. В противоположность R. rubrum Treponema pallidum переживала высокие концентрации глицерина, не теряя подвижности. В присутствии 15—25% глицерина спирохеты переносили 8 циклов замораживания и оттаивания без снижения активности. Когда кролику вводили взвеси спирохет, содержащие глицерин, инкубационный период не увеличивался. Если взвеси в сыворотке или солевом растворе один-два раза перед прививкой замораживали и оттаивали, инкубационный период значительно удлинялся, а после 4-го замораживания и оттаивания микроорганизмы совершенно утрачивали вирулентность. И наоборот, обработанные глицерином взвеси, 4 раза замороженные и оттаянные, судя по продолжительности инкубационного периода, оставались вирулентными. Когда прививали обработанный глицерином материал, перенесший 16 циклов замораживания и оттаивания, инкубационный период удлинялся в среднем на 4 дня. Это свидетельствовало об утрате вирулентности приблизительно на 90%. Однако смертность спирохет в данном случае может быть связана с продолжительностью периода оттаивания, поскольку незамороженные микроорганизмы, находившиеся в течение такого же периода времени при комнатной температуре, также теряли вирулентность. Когда взвеси Т. pallidum хранили 2 месяца при температуре —709 в смеси сыворотки с физиологическим раствором, содержащей 15% глицерина, они не утрачивали вирулентности, о чем можно было судить по продолжительности инкубационного периода после прививки их кроликам. При хранении обработанного глицерином материала при —40° вирулентность утрачивалась. Тёрнер и сотрудники еще раньше установили, что спирохеты возвратного тифа и T. pallidum сохраняли вирулентность при температуре —79° продолжительное время, но их методика не была достаточно надежной. Только применение глицерина и низких температур разрешило задачу сохранения вирулентных спирохет в лабораторных условиях, устраняя, таким образом, дополнительный труд и опасность, связанные с пересевом культур или прививкой их подопытным животным. Многие виды других микроорганизмов, включая Vibrio foetus, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis и N. gonorrhoeae, которые, по существовавшему ранее мнению, были крайне чувствительны к замораживанию и оттаиванию, также хорошо сохранялись при температуре —10 или —40° в средах, содержащих глицерин.
Холлендер и Нелл полагали, что бактерии разрушаются во время замораживания в результате механического сдавливания, обусловленного расширением воды, превращающейся в лед; глицерин же защищает их, предотвращая это расширение. Сдавливание кристаллами льда, однако, не объясняет линейной зависимости инактивации от температуры, а подобная зависимость обнаруживается при замораживании бактерий, различных бактериофагов и вирусов до различных температур и последующем оттаивании этих микроорганизмов. Трудно понять также, каким образом такие маленькие по сравнению с кристаллами льда организмы могут пострадать от сдавливания, особенно если инактивация наступает при сравнительно высоких температурах, когда между кристаллами еще имеется незамороженная, но сильно концентрированная среда. В то же время маленькие размеры и относительно простая структура микроорганизмов делают белковые вещества чрезвычайно чувствительными к повышенной концентрации электролитов при вымораживании воды. В результате добавления в среду глицерина концентрация электролитов после достижения равновесного состояния с льдом при любой температуре понижается. Глицерин предотвращает повышение концентрации солей до уровня, губительного для бактерий и других организмов во время замораживания. Харрисон и Черрони утверждали, что если основной причиной летальности организмов при замораживании служит механическая травма, то различные виды организмов должны отличаться друг от друга не только чувствительностью к замораживанию, но и физической устойчивостью к механическим травмам любого вида. Они поставили серию опытов, в каждом из которых культуры двух различных организмов подвергли многократному замораживанию, оттаиванию и энергичному встряхиванию вместе с маленькими стеклянными бусинами в гомогенизаторе. Поскольку во всех опытах использовали Escherichia coii, эти бациллы одновременно служили контролем. Они оказались более чувствительными к замораживанию при —22°, чем Microbacterium jiavum или Bacillus pumilus. Escherichia coli, если судить по скорости разрушения бактерий в гомогенизаторе, лучше переносит механическую травму, чем Microbacterium jiavum, и несколько хуже, чем Bacillus pumilus. Escherichia coli и Lactobacillus fermenti приблизительно в равной степени были чувствительны к замораживанию при —22° и последующему оттаиванию, хотя из этих двух организмов первый разрушался в значительно большей степени при механической травме. Отсюда стало ясным, что между физической выносливостью клеток и их устойчивостью к разрушающему действию замораживания и оттаивания не существует никакой связи. Культуры Escherichia coli после аэрации лучше переносили замораживание и оттаивание, но оставались также чувствительными к механической травме. Аэрация могла вызывать биохимические изменения в составе клеток, но вряд ли она влияла на физическую их выносливость. Полученные результаты позволяют предполагать, что причиной разрушения клеток во время образования и растворения кристаллов льда могут быть какие-то особые биохимические процессы.
Харрисон считал, что увеличение концентрации электролитов при замерзании питательной среды может служить основной причиной повреждения бактерий во время замораживания, хранения в замороженном состоянии и последующего оттаивания. Он провел ряд опытов, чтобы выявить, влияет ли снижение исходной концентрации на выживаемость бактерий, замороженных и хранящихся при температуре —22°. Результаты этих опытов показывают, что в соответствии с теорией при разбавлении питательной среды выживаемость Escherichia coli повышалась и была наибольшей, когда бактерии взвешивали в дистиллированной воде. Подобные же результаты были получены и с Serratia marcescens (Bacterium prodigiosum). В опытах с Lactobacillus fermenti число жизнеспособных клеток во взвесях понижалось, когда среду разбавляли в 10 раз, но повышалось при разбавлении в 100 раз при использовании дистиллированной воды в качестве суспензионной среды.
В данной среде хлористый натрий присутствовал в более высокой концентрации, чем другие электролиты. Кроме того, он растворялся лучше других солей и имел сравнительно низкую эвтектическую точку. Харрисон установил, что 4,1 или 4,6 М раствор хлористого натрия не замерзает при длительном хранении при температуре —22°. Он сравнил выживаемость бактерий после замораживания до —22° в бульоне и после воздействия 4,6 М раствором NaCl при —22° в незамороженном состоянии. Кривые выживаемости в обеих сериях опытов не отличались друг от друга. В первый день пребывания микроорганизмов при температуре —22° наблюдалась высокая смертность. С течением времени интенсивность смертности понижалась как среди бактерий, находившихся в замороженном бульоне, так и среди бактерий, взвешенных в незамороженном солевом растворе при —22°, так что наклон кривых выживания непрерывно уменьшался. В обеих группах опытов процент переживших микроорганизмов зависел от первоначальной концентрации клеток. Как было показано ранее для взвесей, замороженных при —22°, смертность была тем выше, чем меньше было исходное число жизнеспособных бактерий. Когда различные организмы предварительно культивировали в условиях усиленной аэрации, выживаемость повышалась независимо от того, замораживали ли их в бульоне при —22° или выдерживали в 4,6 М растворе хлористого натрия в незамороженном состоянии при температуре —22°.
Выживаемость Escherichia coli, Lactobacillus fermenti и некоторых других микроорганизмов можно значительно повысить путем добавления в бульон, в котором они взвешены, глицерина. Харрисон показал, что глицерин, кроме того, предотвращает летальное воздействие на эти организмы концентрированных незамороженных растворов хлористого натрия при температуре —22°. Он готовил 5,9 М раствор глицерина и 4,6 М раствор NaCl, которые не замерзали при —22°, и смешивал их в различных пропорциях. Затем взвешивал в этой смеси бактерии и хранил их при —22°. Наличие 4,1 М глицерина снижало процент гибели Escherichia coli и Lactobacillus fermenti, инкубированных в 1,4 М NaCl при —22° в незамороженном состоянии. Интересно, что при высокой концентрации глицерина в дистиллированной воде наблюдалась гибель большого числа взвешенных бактерий L. fermenii, но такая же концентрация этого вещества при наличии хотя бы следов электролитов не была токсичной. Так, присутствие 0,05 М NaCl было достаточным для обеспечения максимальной выживаемости L. fermenti в 5,9 М растворе глицерина при —22°.
В других опытах на протяжении недели подсчитывали число жизнеспособных клеток во взвесях Escherichia coll., выдерживавшихся при температуре -20° в растворах с различным содержанием глицерина и хлористого натрия. Наибольший процент выживаемости был получен в чистых 5,9 М растворах глицерина. В растворах глицерина и хлористого натрия число выживших микроорганизмов было тем больше, чем выше было содержание глицерина по отношению к NaCl.
В тех случаях, когда взвеси бактерий несколько раз замораживали при —20°, хранили при этой температуре и затем оттаивали спустя различные периоды времени — от одного дня до нескольких недель, кривые выживания имели весьма своеобразный вид. Почти аналогичные кривые были получены, когда взвеси Lactobacillus fermenti по нескольку раз инкубировали в незамороженных растворах концентрированного (4,6 М) хлористого натрия при —22° и в обычной бактериологической среде. Полученные данные послужили дальнейшим подтверждением точки зрения, согласно которой во время замораживания и оттаивания некоторые виды бактерий разрушаются не в результате сдавливания кристаллами льда, а вследствие воздействия концентрированных растворов электролитов при температурах, превышающих их эвтектические точки. Процент гибели бактерий после неоднократных периодов пребывания в концентрированных растворах солей и в нормальной среде был значительно ниже при добавлении глицерина.
Результаты, полученные Харрисоном, наглядно подтверждают данные Лавлока, который показал, что первой и, вероятно, наиболее важной причиной повреждения эритроцитов во время замораживания и оттаивания служит повышение концентрации электролитов в среде и внутри клеток в результате вымораживания воды. Лавлок установил, что глицерин препятствует достижению того критического уровня концентрации хлористого натрия и других электролитов, при котором они оказывают вредное действие во время замораживания, хранения при низких температурах и оттаивания. Впоследствии были высказаны предположения относительно других способов защитного действия глицерина. На некоторые клетки, устойчивые к высокой концентрации солей, глицерин оказывает защитное действие во время замораживания и оттаивания, по-видимому, одним из этих способов.
Фокс и Хочкис изучали изменения, происходившие в пневмококках, когда популяцию одного штамма обрабатывали дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) от штамма, обладающего другими генетическими признаками. Среди вновь образовавшихся клеток первого штамма проявлялись клетки с характерными признаками того штамма, от которого была взята ДНК. Свойство восприимчивости к чужеродной ДНК в разрастающихся популяциях носит временный характер. Однако культуры, достигшие определенного физиологического состояния, выживали и сохраняли свойство восприимчивости в течение трех месяцев, если их взвешивали в среде с примесью 10% глицерина и хранили при температуре —20°. Такие клетки в присутствии глицерина сохраняли жизнеспособность при —20° в течение 18 месяцев, а после этого срока клетки, в основном утратившие свойство непосредственной восприимчивости, удавалось вновь активировать с помощью соответствующих мероприятий.
Кроме глицерина, существуют и другие нейтральные растворы, защищающие некоторые виды бактерий от повреждений во время замораживания и оттаивания. Иногда их действие выражается в понижении концентрации солей в среде, окружающей микроорганизмы. Для ряда бактерий решающее значение имеет скорость охлаждения и согревания. Мазур и сотрудники нашли, что при охлаждении взвесей Pasleurella tularensis в физиологическом растворе, содержащем желатину, до температуры ниже —30° и последующем медленном согревании процент гибели был достаточно высоким. Когда же взвеси микроорганизмов охлаждали и согревали аналогичным образом в водных растворах, содержащих глюкозу или лактозу, процент гибели был ниже.
Обезвоживание не оказывало влияния на защиту клеток ввиду эффективного действия изотонических и гипотонических растворов сахаров. Витрификация не могла происходить, так как разбавленные растворы сахаров были наиболее эффективны тогда, когда взвеси бактерий охлаждали медленно со скоростью 1° в 1 мин. Скорость охлаждения и согревания сильно влияла на выживаемость P. tularensis при температуре ниже —20° в физиологическом растворе, содержащем желатину. Процент выживших клеток в этом растворе при любой данной температуре можно было повысить при помощи медленного охлаждения и быстрого оттаивания. Использование в таких условиях в качестве среды водных растворов сахаров давало лишь незначительное преимущество. Наибольший процент гибели во время хранения наблюдался при —45°; при 71° он был ниже, чем при —60°. Гибель клеток была относительно небольшой в физиологическом растворе с желатиной при температуре —15 или —30°.
Показана взаимосвязь между различными факторами, влияющими на гибель P. tularensis после замораживания в физиологическом растворе с желатиной. Взвеси, охлажденные до температуры выше —30°, содержали большое число выживших клеток независимо от скорости их охлаждения и согревания. Выживание клеток, быстро замороженных при температуре ниже —45°, зависело от скорости согревания; процент выживших клеток был низким во взвесях, подвергавшихся медленному согреванию. Медленное согревание было несколько менее губительным для медленно охлаждавшихся клеток. При температуре от—30 до —45°, по-видимому, вступал в действие какой-то фактор, вредно влиявший на последующее медленное согревание. Определение электрической проводимости взвеси при различных температурах показало, что эвтектическая точка лежит между —30 и —35°. Здесь медленное охлаждение оказывало положительное влияние, так как оно давало время для внеклеточной кристаллизации и постепенного обезвоживания клеток. Быстрое же охлаждение приводило к внутриклеточной кристаллизации, а последующее постепенное оттаивание кристаллов внутри самих клеток повреждало последние. Иногда медленное охлаждение приводило к переохлаждению клеток; тогда быстрое согревание уменьшало опасность внутриклеточной кристаллизации.
Большой интерес представляет то обстоятельство, что бактерии P. tularensis, подобно сперматозоидам, эритроцитам, клеткам яичников и многим другим тканям млекопитающих, лучше переносят низкие температуры при медленном охлаждении и быстром согревании. Следует подчеркнуть, однако, что клетки млекопитающих и бактерии чувствительны к быстрому охлаждению в различных температурных зонах и что механизмы температурного шока и инактивации во время медленного оттаивания у них могут отличаться. Как ни трудно дать объяснение полученным результатам, они все же могут иметь некоторое практическое значение; в частности, они облегчают диагностирование туляремии — болезни, часто встречающейся у овец и грызунов и редко у человека Диагносцирование этой болезни требует применения трудоемкой методики выделения возбудителя из пораженных желез. В настоящее же время ткань можно охладить, хранить при определенной температуре и в таком виде транспортировать в соответствующую лабораторию для анализа.
Многие виды бактерий переживают высушивание при обычной комнатной температуре или же путем возгонки льда в вакууме при температуре ниже нуля. Некоторые из них при консервации в высушенном состоянии сохраняют в какой-то степени жизнеспособность. У других процент гибели во время консервации очень высок. Если нужно лиофилизировать культуры, необходимо свести гибель клеток во время замораживания до минимума. С практической точки зрения это один из наиболее важных доводов в пользу интенсивного изучения действия замораживания на бактерии различных родов и видов. Более того, некоторые микроорганизмы, погибающие при высушивании, можно хранить в замороженном состоянии при низких температурах либо в обычных средах, либо в средах, разбавленных глицерином или другими защитными агентами.
В настоящее время еще не получены достаточно убедительные данные о том, что во время замораживания бактерии погибают в результате раздавливания или какого-либо другого механического воздействия со стороны внеклеточных кристаллов льда. Возможно, что и внутриклеточная кристаллизация также представляет опасность, особенно при медленном оттаивании микроорганизмов. Бактерии некоторых видов гибнут при одной и той же температуре как в замороженных взвесях, так и в концентрированных, но не затвердевших растворах. Благодаря возможности производить точный подсчет бактерии представляют собой особенно подходящий объект для исследования действия любого физического или химического агента. Следует, однако, иметь в виду, что выводы, полученные в опытах на бактериях, не всегда можно применить к клеткам высших животных и что у различных видов бактерий наблюдается различный процент гибели во время охлаждения и храпения при низких температурах.