В связи с изучением замораживания сперматозоидов и эритроцитов млекопитающих и птиц с применением глицерина и без пего возникло много различных подлежащих разрешению проблем.
Так, например, не было ясно, изменяется ли биохимическая активность клеток в результате замораживания, высушивания и хранения при низкой температуре и полностью ли прекращаются в клетках метаболические процессы или они только сильно замедляются во время хранения при температуре —79 и —190°. Предварительные опыты на дрожжах поставили перед исследователями новые проблемы и показали трудность применения готовых выводов, полученных при изучении одного вида клеток, к другим, даже близкородственным видам. В своих опытах мы использовали четыре штамма Saccharomyces cerevisiae, а именно: S. cerevisiae Thorne, S. cerevisiae Gebruder-Meyer, S. cerevisiae 212 и S. cerevisiae D. C. L., а кроме того, дрожжи других родов, в том числе Pichia alcohotophila (штамм Carlsbcrg), Torulopsis utiiis var. major (штамм С. М. I. 33 552) и Schizosaccharomyces octosporus (штамм Beij. Galloway).
Качественные исследования показали, что в питательных средах, быстро охлажденных до температуры —79 или —190°, выживало очень мало клеток. Процент выживших клеток не увеличивался и тогда, когда осадок бульонных культур перед замораживанием вновь суспендировали, но уже в дистиллированной воде. Медленное оттаивание оказывало более разрушающее действие, чем быстрое.
Процент выживших клеток в пробах, согретых спустя 2 час и спустя сутки, был почти одинаковым. Предварительные исследования показали, что дрожжи всех штаммов и видов хорошо размножались в бульонной культуре, содержащей 15% глицерина. При быстром охлаждении таких культур до —79 или —190° выживало много клеток. Процесс гибели клеток в простом бульоне, а также в бульоне с примесью 15% глицерина повышался при медленном охлаждении до —79 или —190°.
Количественные исследования показали, что дрожжи различных штаммов и видов отличались по своей чувствительности к быстрому охлаждению. Из дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae штамм Gebruder-Meyer оказался наиболее устойчивым к быстрому охлаждению в простом бульоне, а штамм 212 — наиболее чувствительным. Штамм Thorne был чувствительнее штамма Gebruder-Meyer, но устойчивее штаммов D. С. L. и 212. В различных опытах 99,5—99,98% клеток штамма Thorne погибло при быстром охлаждении до —79°. Чем сильнее было разбавление, тем больший процент клеток выживал. Очень мало клеток выживало при замораживании сухого остатка. Даже при самых лучших условиях в бульонных культурах штамма 212 погибало 99,99% клеток. Молодые (неспорообразующие) культуры Schizosaccharomyces octosporus оказались высокочувствительными к холоду, тогда как культуры, образующие большое количество спор, хорошо переносили быстрое охлаждение. Torulopsis uliiis и Pichia alcoholophila переносили охлаждение несколько лучше, чем Saccharomyces cerevisiae Thorne. Во всех случаях наибольшее число клеток погибало в сухих остатках и в концентрированных взвесях как при быстром замораживании, так и при медленном согревании. Процент дрожжевых клеток, переживших сверхбыстрое замораживание и оттаивание в пленках культуры на платиновых петлях, был меньше, чем при быстром охлаждении маленьких объемов культуры в узких пробирках.
При медленном охлаждении до —79° и быстром согревании в бульонных культурах различных видов дрожжей выживало довольно много клеток. В некоторых опытах, проведенных на разбавленных культурах, переживало 75% клеток S. cerevisiae Gebruder-Meyer и 25— 75% S. cerevisiae Thorne. При медленном охлаждении бульонной культуры S. cerevisiae 212 до —79° выживало 50—90% клеток. При быстром же замораживании в пробах этих культур погибали все клетки. Число жизнеспособных клеток в бульонных культурах Pichia alcoholophila, Torulopsis utiiis и Schizosaccharomyces octosporus увеличивалось при медленном охлаждении и быстром согревании и составляло 30—80%. Приведенные данные свидетельствуют о поразительных отличиях в устойчивости близкородственных штаммов, видов и родов к замораживанию и оттаиванию.
За исключением молодых (неспорообразующих) культур Schizosaccharomyces octosporus, большой процент живых клеток обнаруживался в бульонных культурах дрожжей с примесью 15% глицерина при быстром охлаждении до —79°. Некоторые штаммы Saccharomyces cerevisiae, а также Pichia alcoholophila в таких условиях выживали лучше, чем в простых бульонных культурах, медленно охлаждаемых до —79°. Замораживание при —79° Saccharomyces cerevisiae D. С. L., разбавленных в культурах, содержащих 15% глицерина, не изменяло числа жизнеспособных клеток. При быстром охлаждении других штаммов и видов дрожжей в глицеринизированных культурах погибало 5—25% клеток. Значительно меньше погибало клеток при медленном охлаждении до —79°. У клеток различных видов и штаммов дрожжей, переживших быстрое или медленное охлаждение до низких температур, сохранялись характерные реакции сбраживания.
Отцентрифугированные осадки простых бульонных культур, вновь взвешенные в 15-процентном растворе глицерина, не испытывали губительного действия быстрого замораживания, если их выдерживали в этом растворе не менее 2—3 час. Судя по числу клеток, выживших в быстро охлажденных до —79° и затем согретых взвесях. Оптимальный срок контактирования с 15-процентным раствором глицерина составлял 3—4 час. Отцентрифугированные осадки дрожжей, культивированные в 15-процентном растворе глицерина, не переживали быстрого охлаждения до температуры —79°. Когда из этих осадков перед замораживанием вновь готовили взвесь в простом бульоне, в ней обнаруживали незначительное число живых клеток. Полученные результаты навели на мысль о целесообразности использования глицерина для предохранения клеток от повреждений при быстром охлаждении.
Клетки дрожжей, культивированные или взвешенные в течение нескольких часов в бульоне, содержащем 5% глицерина, по всем признакам не были защищены от повреждений при быстром охлаждении. Лишь немногим выше была степень защитного действия и 7,5-процентного раствора глицерина на дрожжи некоторых видов и штаммов. Следовательно, минимальная эффективная концентрация глицерина для различных штаммов S. cerevisiae, а также для Pichia alcoholophila и Torulopsts utilis должна составлять 15% (по объему). Ввиду высокой устойчивости к быстрому охлаждению взрослых культур специальная методика для защиты молодых (неспорообразующих) культур Schizosaccharomyces octosporus не была разработана.
В дальнейшем были проведены опыты с целью выявления интервала низких температур, в котором целесообразно применять медленное охлаждение. Как показали предварительные опыты, в разбавленных культурах, сначала медленно охлажденных до —8 или —15°, а затем быстро охлажденных до температуры —79°, выживало небольшое число клеток. Невысокий процент гибели наблюдался во всех культурах дрожжей, быстро замороженных при —15 или —20°, тогда как в разбавленных культурах чувствительного штамма Saccharomyces cerevisiae 212, быстро охлажденных до —30°, этот процент был достаточно высоким, а при быстром охлаждении до —40° погибали все клетки. Резко повышалось число погибших клеток в культурах дрожжей других штаммов, видов и родов при быстром охлаждении до любой температуры ниже —30°. Хорошие результаты удалось получить во всех опытах, когда культуры, быстро охлажденные до —15°, затем медленно, со скоростью около 2° в 1 мин, охлаждали до температуры —79°. Когда скорость охлаждения в интервале от —15 до —79° увеличивали примерно до 5° в 1 мин, процент выживших клеток после оттаивания был несколько ниже.
Поведение дрожжевых клеток резко отличалось от поведения сперматозоидов млекопитающих. Основная предпосылка выживания сперматозоидов заключалась в медленном охлаждении до —15°. Затем в интервала от —15 до 79° можно было без ущерба для клеток повышать скорость охлаждения. Следовательно, заключения, сделанные на основании опытов на дрожжах, вряд ли можно применять к клеткам млекопитающих.
Позднее Ней и сотрудники показали, что чем больше скорость охлаждения взвесей S. cerevisiae, тем тяжелее повреждения. При согревании со скоростью 3 или 15° в 1 мин разница в результатах была невелика. Эти авторы нашли, что взвеси клеток в гипертонических растворах глюкозы сильнее повреждались при замораживании и оттаивании, чем взвеси в дистиллированной воде. Критерием повреждений служили дифференциальное окрашивание живых и мертвых клеток метиленовым синим, скорость сбраживания (судя по выделению СО2) и каталазная активность взвеси.