Факультет

Студентам

Посетителям

Репаративные процессы у грибов

Определяющее значение в устойчивости живых организмов к УФ-лучам принадлежит процессам фотореактивации и темновой репарации, способствующим восстановлению клеточного генома от лучевых повреждений (Самойлова, 1967; Жестяников, 1968, 1979; Сойфер, 1969; Rupert, 1975; Harm, 1975; Захаров, 1979; Левин, 1979). Эти процессы изучаются на широком круге объектов на популяционном, клеточном и молекулярном уровнях.

Фотореактивация

Фотореактивацию, или восстановление на свету впервые наблюдал Kelner (1949) на грибе Penicillium notatum и Streptomyces sp. Это явление впоследствие было подтверждено на бактериях, грибах, вирусах, некоторых простейших, насекомых, культурах тканей животных и растений, на изолированных препаратах ДНК (Dulbecco, 1955; Jagger, 1958; Setlow, 1967; Самойлова, 1967; Дубров, 1968). Процесс фотореактивации происходит под действием спектрального света любой длины волны, кроме ультрафиолетового (Жестяников, 1979; Левин, 1979). Интенсивность его зависит от дозы и мощности излучения. Фотореактивация не наблюдалась при облучении микроорганизмов в сухом и замороженном состоянии (Левин, 1979). Этот процесс может происходить одновременно с облучением УФ-лучами, если последнее проводится на свету, поэтому УФ-облучение всегда проводят в темноте, а посев облученного материала — в затемненном помещении при красном свете.

Сущность процесса фотореактивации с участием фермента фотолиазы состоит в расщеплении на свету димеров пиримидиновых оснований, образующихся в ДНК при УФ-облучении, до мономеров. Единственным источником энергии, необходимой для активации фотолиазы, является видимый свет. Об этом свидетельствует одинаковая интенсивность процесса фотореактивации в присутствии кислорода и в анаэробных условиях, а также независимость его от ингибиторов дыхания (Самойлова, 1967; Смит, Хэнеуолт, 1972).

Наряду с ферментативной существуют и другие способы фотовосстановления пораженной структуры ДНК (Rupert, 1975; Harm, 1975; Жестяников, 1979).

Фотореактивацию микроорганизмов на клеточном уровне можно изучать с помощью разных методических приемов. Один из них состоит в освещении видимым светом предварительно облученной определенной дозой УФ-лучей клеточной суспензии и посевом ее через разные промежутки времени на питательную среду (Dulbecco, 1955; Jagger, 1958). Описанный метод позволяет выявить динамику процесса фотореактивации. По другому методу, выживаемость конидий определяли после облучения их разными дозами УФ-лучей с последующим однократным освещением видимым светом (Haynes, 1968; Sarachek, Greland, 1970; Pathrick, Sarachek, Pettriess, 1974; Moseley, Copland, 1975). Jagger (1958) предложена формула определения уровня фотореактивации:

Ph = (Ne — Nd) : (No — Nd) ∙ 100,

где No — выживаемость клеток в необлученном контроле;

Nd — выживаемость клеток непосредственно после облучения;

Ne — выживаемость клеток на свету.

Е. Н. Кабаков и В. И. Корогодин (1966) математически описали динамику процесса фотореактивации для дрожжей Saccharomyces vini. Уравнение сводится к выявлению эффективной дозы Dt, которая определяется компонентой необратимого поражения, т. е. долей первичных поражений клеток, неспособных к фотореактивации, и скоростью самого процесса. Показателем процесса ферментативной фотореактивации на субклеточном уровне является восстановление активности УФ-облученной трансформирующей ДНК на свету в присутствии гомогената клеток исследуемого объекта (Cook, 1970). Механизм фотореактивации на молекулярном уровне к настоящему времени в значительной мере расшифрован, однако до конца не выяснены природа и механизм действия фермента фотолиазы, индуцирующего расщепление димеров ДНК до мономеров. Удалось выявить различия между фотолиазой грибного (дрожжи) и бактериального происхождения. Установлено, что фотолиаза Е. coli и Streptomyces griseus имеют белковую природу с молекулярной массой около 40 000 Д и не содержит субъединиц. Фотолиаза Saccharotnyces cerevisiae состоит из двух субъединиц (60 000—80 000 Д). По данным Rupert (1975), УФ-облученная ДНК специфична в стереохимическом отношении. Образовавшиеся пиримидиновые димеры имеют форму «седла» и только к ним присоединяется фотолиаза (Helene, Charlier, 1977). В опытах in vitro было показано участие производных индола в образовании межмолекулярных комплексов с основаниями облученной ДНК и сенсибилизация ими разрушения пиримидиновых димеров (Toulne et al., 1974; Charlier, Helene, 1975). Аналогичным образом действовал синтезированный полипептид типа лизин-триптофан-лизин. На свету в образовавшемся комплексе димер-индол электрон переносится с индольного кольца на димер, вызывая его расщепление. Расчетные данные энергетических уровней триплетного и синглетного состояния, например серотинина, а в ДНК — тимина и цитозина показали возможность переноса энергии от серотонина к ДНК. Таким образом, есть основания предполагать, что производные индола, подобно фотолиазе, могут осуществлять аналогичные процессы в живой клетке.

Сформулированная на этом основании гипотеза Helene объясняет необычно большое количество фермента фотореактивации у ряда биологических объектов, в том числе в клетках, которые никогда не освещаются солнечными лучами (печень глубоководной рыбы). Примечательно, что фотореактивация обнаружена в митохондриальной ДНК дрожжей, не имеющих фотолиазы.

Процесс фотореактивации (по критерию выживаемости) изучен на довольно ограниченном количестве видов гифальных и базидиальных грибов: Penicillium notatum, Р. chrysogenum (Kelner, 1949), Ustilago maydis (Jagger, 1958), Neurospora crassa и ее мутантах (Ferry, Kilbey, 1967), Aspergillus carbonarius (Curtis, 1970), Botrytis cinerea (Чеботарев, Землянухин, 1971). Способность дрожжей к фотореактивации исследована у 83 видов, относящихся к 12 совершенным и 10 несовершенным родам (Sarachek, Greland, 1970). Авторы показали ошибочность объединения в пределах одного рода видов, способных к фотореактивации и дефектных по этому признаку. Это подтвердили результаты других авторов, полученные с помощью цитологических, серологических и биохимических методов. Таким образом, фотореактивация у дрожжей изучается не только в связи с их устойчивостью к УФ-лучам, она имеет значение на уровне рода.

У дрожжей неспособность к восстановлению на свету, согласна существующим представлениям, — явление вторичное и обусловлено большей частью случайными мутациями. По выдвинутой авторами гипотезе, защита от УФ-облучения не всегда связана с фотореактивацией, так как роды, обладающие способностью к фотореактивации и дефектные по этому признаку, встречаются в одинаковых экологических нишах.

Мы изучали фотореактивацию у исходного штамма Cladosporium transchelii 396 и трех его мутантов — Ч-1, К-1 и БМ. Суспензию конидий каждого штамма облучали в течение 150, 15 и 5 мин соответственно, после чего в каждой из облученных суспензий оставалось 2% живых клеток (Жданова та iн., 1977).

Завершение фотореактивации у всех изученных культур наступало в среднем после 60—80-минутной экспозиции. Полученные характерные кривые восстановления не отличались от ранее известных на фагах, Е. coli, дрожжах (Dulbecco, 1955; Кабаков, Корогодин, 1966; Завольная, 1970). В большой степени фотореактивация выражена у мутанта БМ и светлоокрашенного мутанта К-1. После 2-часового освещения суспензий конидий этих грибов видимым светом выживало 80 и 55—60% конидий соответственно. Фотореактивация УФ-устойчивых исходной культуры С. transchelii и мутанта Ч-1 заканчивалась через 60 мин, выживаемость конидий у С. transchelii не превышала 15—20%, а у мутанта Ч-1 — 10%. Уменьшение степени фотореактивации устойчивых к УФ-лучам культур объясняется также присутствием меланина в оболочках конидий. Пигмент адсорбирует не только УФ-лучи, но и видимый свет, предотвращая поражение клеточного генома и активацию фотолиазы.

В условиях нашего эксперимента поражение ядерного аппарата, субстрата для фермента фотореактивации, примерно одинаково (выживаемость составляла 2%), а потому лимитирующим фактором в такой ситуации может быть активность фотолиазы. следовательно, при отсутствии или слабой меланиновой защите у высокочувствительных светлоокрашенных мутантов БМ и К-1, фотореактивация от УФ-повреждений происходит наиболее интенсивно. Несмотря на это обстоятельство, крайние по степени пигментации мутанты Ч-1 и БМ по устойчивости к УФ-облучению различались более чем на три порядка. Мы полагаем, что устойчивость изученных грибов наряду с фотореактивацией определяется фотозащитной функцией меланиновых пигментов. Для окончательного суждения необходимо провести эксперименты на изолированной облученной ДНК и гомогенатах соответствующих грибов.

Явление фотореактивации установлено для штаммов Neurospora crassa по критерию выживаемости и способности экстрактов гриба восстанавливать УФ-облученную изолированную ДНК (Ferry, Kilbey, 1967). Это свидетельствует о ферментативной природе процесса; он достигает максимума через 90 мин после облучения (Chang, Tuveson, 1967).

В естественных условиях микробные и грибные организмы подвергаются воздействию длинноволновых (ДУФ, 320 нм) и средневолновых УФ-лучей (СУФ, 280—315 нм), однако фотореактивация происходит только после облучения коротковолновыми (КУФ, 254 нм) и СУФ-лучами. Последние не поглощаются ядерной ДНК, но имеющиеся в цитоплазме фоторецепторы реагируют на это излучение, поглощенная ими энергия вызывает повреждение ДНК и нуклеиновых кислот (Левин, 1979). Продолжительное облучение УФ-лучами приводит к летальному повреждению белковых молекул, однако, подобно видимому свету, ДУФ-лучи способствуют фотореактивации от вызываемых СУФ- и КУФ-лучами повреждений.

В настоящее время значительно расширены представления о субстратах фотолиазы — к ним относятся не только пиримидиновые димеры, но фотопродукты, возникающие в РНК при облучении ее СУФ-лучами (Pollard, 1974; Левин, 1979). По-видимому, подобные исследования следует провести и на грибах.

Таким образом, явление фотореактивации изучено пока что на ограниченном количестве грибов. Детальное изучение этого процесса у дрожжей позволило выявить виды, способные и неспособные к фотореактивации. Неясно, насколько это свойство распространено среди других представителей огромного грибного царства. Пока не объяснены причины отсутствия фотореактивации у ряда видов грибов. На примере меланинсодержащих гифомицетов обнаружена зависимость интенсивности фотореактивации от содержания меланина в их клеточных оболочках.

Темновая репарация у грибов

Явление темновой репарации (ТР), которое вначале изучали на бактериях, состоит в восстановлении структуры ДНК, нарушенной облучением или воздействием любого другого неблагоприятного фактора.

Исследования механизма этого процесса были проведены в 60-х годах (Hill, Simson, 1961; Hanawalt, Haynes, 1965). Процесс репарации включает последовательное выявление участка поврежденной ДНК, разрез одной нити, выщепление поврежденного участка, расширение его эндонуклеазами, застройку бреши, соединение нового участка с основной нитью ДНК (Жестяников, 1968; Сойфер, 1969; Бреслер, 1973). Такой способ репарации назван эксцизионным. В 60—70-х годах этот феномен обнаружили у большого числа эукариотов, в том числе и у грибов. Обстоятельный обзор, посвященный ТР дрожжей, представили И. А. Захаров и др. (1979). Мы остановимся кратко на состоянии изученности этого вопроса на видах грибов, принадлежащих к другим классам.

Наиболее общим показателем наличия ТР является увеличение выживаемости облученной УФ- или γ-лучами споровой суспензии после выдерживания ее в воде (Корогодин, 1966; Bhattacharya et al., 1973; Василевская, 1976; Жданова та iн., 1977). Установлена зависимость степени пострадиационного восстановления (ПРВ) Saccharomyces vini штамма Мегри 131 после облучения γ-лучами от дозы, ее интенсивности, условий культивирования, организма, состава питательной среды (Корогодин, 1966). Экспозиция в темноте УФ-облученных конидий Aspergillus terreus приводила к увеличению их выживаемости и снижению количества мутаций (Bhattacharya et al., 1973). В дальнейшем появились сообщения (Василевская, 1976; Жданова, 1976; Жданова та iн., 1977), посвященные изучению этого явления на гифальном грибе Cladosporium transchelii и его цветных мутантах. Выживаемость γ- и УФ-облученных конидий после выдерживания в воде увеличивалась. При этом интенсивность процесса темновой репарации зависела от дозы облучения, увеличиваясь с возрастанием дозы γ-лучей от 200 до 600 крад. Статистически достоверных различий в уровне процессов ПРВ и ТР у цветных мутантов Ч-1 и БМ по сравнению с исходной культурой не обнаружено. Это обстоятельство послужило основанием для заключения об определяющем значении меланинового пигмента в их γ- и УФ-устойчивости.

Исследования Sommer et al. (1963, 1965) показали, что спорангиоспоры Rhizopus stolonifer, высеянные сразу после γ-облучения, только прорастали, но колоний не образовывали. При повышенной концентрации спор в воде прорастание их замедлялось, что способствовало более полному проявлению ПРВ. Выживаемость облученных спор при этом увеличивалась от 1% (исходный уровень) до 25—50%. Добавление хлорамфеникола (ингибитора белкового синтеза) угнетало восстановление от обратимых радиационных поражений.

Качественно новый этап в исследовании ТР представляет изучение изолированной УФ-облученной и необлученной ДНК с привлечением современных методов генетики, биохимии, биофизики, молекулярной биологии. Исследование темнового восстановления УФ-облученной ДНК Neurospora crassa проводили с применением игибиторов ТР — кофеина, частично подавляющего выщепление пиримидиновых димеров, и профлавина, полностью подавляющего этот процесс (Worthy, Elper, 1973). Основными этапами репарации УФ-облученной ДНК являлись выщепление образовавшихся димеров и восстановление однонитевых разрывов. С помощью седиментационного анализа определили молекулярную массу облученной ДНК, оказавшуюся на два порядка меньше по сравнению с необлученной. Применение ингибиторов выщепления димеров (кофеин, профлавин) и образования однонитевых разрывов (кинокрин) позволило выявить роль каждого из процессов в поражении ДНК. Анализ полученных данных позволяет заключить, что эти процессы локализованы в разных участках ДНК. О репарирующем синтезе судили по включению изотопа 32Р. По мнению авторов, определяющим в устойчивости клеток гриба к УФ-облучению является время выщепления образовавшихся димеров. При быстром выщеплении клетка восстанавливается без повреждений, медленное восстановление может приводить к образованию мутаций или гибели клеток. С увеличением дозы облучения количество необратимых поражений нарастает и способность к репаративному синтезу снижается.

Изучение процесса выщепления пиримидиновых димеров у базидиомицета Ustilago maydis проведено Unrau (1975). Наряду с исходной культурой исследовали три УФ-чувствительных мутанта, два из которых были дефектны по рекомбинации и один — по выщеплению димеров. Исходная культура оказалась устойчивой к УФ-лучам: при дозе 300 Дж/м2 выживаемость ее составляла более 90%. Подобно Neurospora crassa при малых дозах УФ-лучей (150—300 Дж/м2) у исходного штамма и мутантов, дефектных по рекомбинации, все димеры практически удалялись. С увеличением дозы облучения процесс замедлялся и появлялись остаточные димеры, у rec-мутантов выщепление происходило сразу после облучения и спустя 3 ч. Заметно отличалось поведение мутанта, дефектного по выщеплению димеров. Удаление димеров у него ингибировалось после доз выше 100 Дж/м2, но при меньших дозах оно начиналось только после 1—2-часового латентного периода. В то же время выживаемость мутанта оставалась достаточно высокой. Автор выделяет два этапа в процессе репарации поврежденной ДНК Ustilago maydis: восстановление посредством выщепления пиримидиновых димеров, протекающее сразу после облучения и широко известное у бактерий и дрожжей, и рекомбинированное восстановление, которое зависит от белкового синтеза, оно начинается через 90—120 мин после облучения и заканчивается через 4—5 ч. Таким образом, в ряде случаев восстановление у эукариотов осуществляется значительно сложнее, чем у прокариотов. Unrau не сравнил свои результаты с известными в литературе, вследствие чего неясно, насколько процесс выщепления пиримидиновых димеров и репликации ДНК Ustilago maydis более интенсивен, чем у других грибов.

Проведено изучение ПРВ гриба Dictyostelium discoideum по критерию выживаемости исходного штамма и его мутантов (Deering, 1968). В работе, посвященной восстановлению УФ-облученной ДНК Dictyostelium discoideum использованы устойчивый и чувствительный к γ-излучению штаммы (ЛД90 — 200 и менее 1 Дж/м2 соответственно) (Gualis, Deering, 1976). Подобно Neurospora crassa и Ustilago maydis у обоих штаммов D. discoideum сразу после облучения заметно уменьшалась молекулярная масса ДНК, вследствие однонитевых разрывов, которые у резистентного штамма восстанавливались через 3,5 ч, а у чувствительного — через 12 ч. При дозе УФ-лучей 100 Дж/м2 у обоих штаммов образовалось до 60% темновых димеров, из которых после 3-часовой инкубации в темноте оставалось только 15%, т. е. скорость удаления димеров у них одинакова. Наблюдаемые различия в устойчивости штаммов D. discoideum авторы связывают с нарушениями в репаративной системе, которые проявляются после вырезания пораженных участков ДНК при восстановлении. У чувствительного штамма, вероятно, нарушен также контроль координации между ферментом репарации и нормальным синтезом ДНК.

И. А. Захаров и др. (1979) обосновали целесообразность изучения механизмов ТР именно у дрожжей. Преимущества такого изучения состоят в том, что для дрожжей как одноклеточных простейших эукариотов применимы практически все генетические методы, известные для бактерий, что сделало возможным детальное изучение их генетики. Авторы предлагают называть пострадиационное восстановление восстановлением при задержке деления (ВЗД). Процесс ВЗД у эукариотов и прокариотов не одинаков. О существенных различиях свидетельствует удаление из облученной ДНК дрожжей димеров, а также потребность в синтезе белка при восстановлении от летальных повреждений у γ-облученных сахаромицетов. У бактерий аналогичный процесс может протекать при полном блокировании белкового синтеза. Если ВЗД у дрожжей подавлено, а ТР — нет, то при этом не наблюдается увеличения выживаемости УФ-облученных клеток. Таким образом, в процессе ТР димеры активно удаляются, но новые бреши в ДНК не ликвидируются. С другой стороны, систему ВЗД отличает от ТР способность репарировать различного типа повреждения.

Получены доказательства о наличии у эукариотов (в отличие от бактерий) трех путей репарации, из которых детально изучены два: эксцизионный и пострепликативная рекомбинация. О природе третьего пути репарации известно мало, но существует несколько гипотез по этому поводу. Так, Hannable, Cox (1971) считают, что он обусловлен темновой дорепликативной рекомбинацией; Brendel, Haynes (1973) полагают, что восстановление от повреждений, индуцированных γ-лучами, должно осуществляться не так как при восстановлении от повреждений, вызванных УФ-лучами.

Следует заметить, что исследования подобного рода проведены на одном виде дрожжей — Saccharomyces cerevisiae.

Известные механизмы репарации объясняют ликвидацию одноцепочных разрывов ДНК. Однако ионизирующие излучения большей частью вызывают разрывы двух цепочек ДНК, которые во многих случаях не репарируются. Исследование природы радиоустойчивости таких высокоустойчивых организмов, как Micrococcus radiodurans, заставило предположить существование у него механизмов восстановления разрывов двух цепочек ДНК (Жестяников, 1968). Noseley, Copland (1975) считают, что в основе такого восстановления М. radiodurans лежит процесс рекомбинации. Способность к репарации двойных разрывов ДНК установлена также у эукариотных организмов — на культуре клеток млекопитающих и на дрожжах Saccharomyces cerevisiae. В работах В. К. Королева, Л. М. Грачевой (1972) и Resnick (1976, цит. по Захарову и др., 1979) приведена схема репарации разрывов ДНК у S. cerevisiae. Первой ступенью репарации авторы считают узнавание концов разрыва нитей ферментом 5’→3′ — экзонуклеазой. Затем происходит ограниченная деградация нитей ДНК, которая разнонаправлена в пораженных нитях ДНК. Она сопровождается образованием гетеродуплекса, который не препятствует репликации ДНК. В результате образуется одна неповрежденная хроматида, а у второй разрывы (бреши) ликвидируются включением ферментов темновой репарации (ДНК-полимеразы, лигазы). Кроме того, предусматривается второй возможный путь репарации, при котором два гетеродуплекса формируются в результате гибридизации двух нитей неповрежденных хроматид с таковыми поврежденной. После образования гибридных молекул ДНК происходит их рекомбинация. Последний процесс, по данным В. Г. Королева, Л. М. Грачевой (1972), у сахаромицетов встречается значительно чаще.

Удачным объектом для исследования репаративных свойств ДНК в митохондриях оказались сахаромицеты, большинство которых относится к факультативным анаэробам. Под влиянием УФ- и ионизирующего излучения у них получены так называемые дыхательные, или «petit» — мутанты, отличающиеся слабым ростом и удобные для идентификации. Возникновение таких мутантов обусловлено нарушениями в митохондриальной ДНК при облучении (Ephrussi, 1953; Moustacchi, Enteric, 1970). Выращивая УФ-облученные клетки Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoides на средах с глюкозой и пируватом, Hixon et al. (1975) наблюдали увеличение количества колоний в условиях задержки деления, свидетельствующее о репарационных процессах в ядерной и митохондриальной ДНК. Эти эффекты удалось разделить, выдерживая облученную малой дозой УФ-лучей клеточную суспензию в воде. При этом наблюдали снижение количества карликовых мутаций, тогда как число нормальных колоний увеличивалось. Добавление кофеина в инкубационную систему стабилизировало количество «petit» мутаций, что происходит вследствие репаративных процессов в ДНК митохондриального происхождения. С увеличением дозы излучения число мутаций линейно увеличивалось. Авторы полагают, что значение митохондриальной ДНК с увеличением времени облучения возрастает.

В результате широкого изучения радиочувствительных мутантов рода Saccharomyces была экспериментально подтверждена гипотеза Лобашева (1963), согласно которой мутации возникают как ошибки репарации. Таким образом, биологическое значение системы репарации в нормальных условиях жизнедеятельности состоит в поддержании стабильности генетического материала клетки.

Источник: Н. Н. Жданова, А. И. Василевская. Экстремальная экология грибов в природе и эксперименте. Киев: Наук. думка, 1982

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: