Факультет

Студентам

Посетителям

Применение глицерина для защиты трихомонад от действия низких температур

Жгутиковые микроорганизмы, в том числе и трипаносомы, были в числе первых простейших, оживших после замораживания и последующего оттаивания.

Однако трихомонады в обычной среде плохо переносят воздействие низких температур. В 1954 г. Мак-Энтегарт испытывал действие глицерина на рост культур трихомонад 4 различных видов (Trichomonas vaginalis, Т. foetus, Т. gatlinae и Т. hominis) и их выживаемость при —79°. Согласно полученным им данным, оптимальный рост наблюдался при содержании в среде 2,5% глицерина, снижение роста — при 5 или 10% и полное отсутствие роста — в 15-процентном растворе глицерина. Попытки удалить глицерин из среды или понизить его концентрацию перед пересевом дали худшие результаты, чем непосредственный пересев взвеси с глицерином в свежую среду. Когда взвеси, содержащие 0, 5 или 10% глицерина, быстро охлаждали, погружая пробирки в замораживающую смесь с температурой—79°, результаты пересева после быстрого оттаивания были крайне неудовлетворительны. В то же время, если взвеси с 5 и 10% глицерина охлаждали медленно, со скоростью, которую применяли при охлаждении Entamoeba histolytica, то Trichomonas vaginalis, Т. gallinae и Т. hominis давали хороший рост после хранения проб в течение 4—6 месяцев при температуре —79°. Затем максимальный период выживания этих микроорганизмов продлили до 12 месяцев, а в отношении Т. vaginalis удалось добиться получения полноценных культур после хранения на протяжении 26 месяцев при —79° в 5-процентном растворе глицерина.

Вызывало удивление, что Т. foetus в отличие от столь близко родственных ему видов трихомонад не переживал замораживания по указанному выше методу. Этот микроорганизм служит возбудителем венерического заболевания у рогатого скота и вызывает септический аборт. Поэтому крайне важно было добиться его сохранения в лабораторных условиях для получения возможности проводить сравнение физиологических и иммунологических свойств у различных штаммов, а также разработки методов химиотерапии. Поскольку данное инфекционное заболевание с трудом поддается лечению, в прошлые годы при постановке диагноза забивали быка и не допускали оплодотворения коров в течение продолжительного времени. Джойнер высказал предположение, что процесс обработки глицерином и замораживания при —79°, который применяли для консервации сперматозоидов, возможно, обладает и другим важным свойством, а именно убивает патогенные трихомонады в сперме быка. Он проверил это теоретическое положение, инфицировав сперму большим числом трихомонад, взятых из культур Т. foetus Belfast или из отцентрифугированного осадка жидкости, которой промывали область крайней плоти зараженных быков. Затем сперму разбавляли цитратно-желточным разбавителем или забуференным снятым молоком до конечной концентрации 10% глицерина и выдерживали 16 час при +5° (по методу Полджа). Обследование проб в конце этого периода показало полную неподвижность жгутиковых, а при пересеве культур в некоторых пробах погибали все микроорганизмы. Сперму медленно охлаждали до —79° (по методу Полджа). Спустя 24 час пробы отогревали, обследовали и проводили пересев культуры. Ни в одном случае не были обнаружены жизнеспособные трихомонады. Когда культуры или взвеси свежевзятых трихомонад выдерживали 16 час при температуре +5°, положительные результаты были получены в образцах с концентрацией глицерина 0 или 15% (но не 10 или 20%). Джойнер подчеркивал необходимость точного соблюдения всех деталей его методики при применении ее для консервации спермы зараженных быков. Малейшие изменения физических условий могут изменить действие глицерина и способствовать выживанию трихомонад. Наилучшим средством прекращения распространения инфекции Джойнер считал забой зараженных быков. Вместе с тем он полагал, что Т. foetus можно удалить из спермы с помощью обычного метода ее консервации при температуре —79° и что иногда складываются такие обстоятельства, когда целесообразно сохранить быка и консервировать сперму.

Данные Джойнера вызвали противоречивые отклики. С одной стороны, Бартель сообщил, что ему удалось на 9% повысить число забеременевших коров в районе, где был широко распространен трихомоиаз, путем одного лишь осеменения коров спермой, обработанной 10-процентным раствором глицерина в цитратно-желточном разбавителе и медленно охлажденной до —79° (по методу Полджа). С другой стороны, Лейдл и Марла обнаружили, что значительное число Т. foetus пережинало медленное охлаждение до —79° и хранение при этой температуре в течение двух дней, когда для приготовления взвеси брали лошадиную сыворотку, содержащую 10% глицерина. Левин и Маркар сообщили, что добавление 5 или 10% глицерина в среду ЦППМ (состоящую из цистеина, пептина, вытяжки печени и мальтозы), в которой культивировали Т. foetus, способствовало выживанию микроорганизмов после замораживания, хранения при температуре —76 или —20° и последующего оттаивания. Число оживших простейших зависело от скорости охлаждения и достигало 80% в тех случаях, когда взвеси охлаждали медленно, со скоростью 1° в 1 мин. Если же пробирки погружали непосредственно в замораживающуюся смесь с температурой —76°, все микроорганизмы погибали. Мак-Уйэд и Уильямс, использовавшие в опытах разбавитель спермы, содержащий 7% глицерина и забуференное молоко, также находили живых Т. foetus в медленно охлажденных пробах, хранившихся при температуре от —73 до —79° в течение 1—125 дней. Блэкшоу и Битти нашли, что Т. foetus сохранял жизнеспособность после замораживания и оттаивания в различных средах в присутствии 5 и 7,5% глицерина. Эти авторы замораживали взвеси тотчас, же после добавления глицерина, а не спустя 16 час пребывания при температуре +5°, как рекомендует Джойнер.

Эти, видимо, противоречивые данные были в дальнейшем проанализированы Левином и сотрудниками, а также Джойнером и Беннетом, которые хорошо понимали, что замораживание при низких температурах в присутствии глицерина открывает широкие возможности как для консервации Т. foetus и других патогенных простейших, так и для удаления их из зараженной спермы или культур. Джойнер и Беннет подтвердили раннее наблюдение, что культуры Т. foetus Belfast и этот же микроорганизм, полученный из жидкости, которой промывали область крайней плоти, не переживали замораживания при —79° и последующего оттаивания при использовании цитратно-желточного разбавителя, содержащего 10% глицерина, в условиях, применявшихся для замораживания бычьей спермы. Эти авторы установили также, что трихомонады, выделенные из промывной жидкости, были более чувствительны к замораживанию и оттаиванию, чем трихомонады этого штамма, полученные из культур. Было высказано предположение, что различные штаммы Т. foetus обладают различной чувствительностью к замораживанию и оттаиванию. Степень токсичности 10-процентных растворов глицерина зависела от среды. Она увеличивалась в присутствии ионов цитрата и уменьшалась, когда разбавитель спермы содержал фосфатный буфер. Оптимальная концентрация глицерина для максимального восстановления жизнеспособности простейших после замораживания при —79° составляла 7,5%, а наилучшими разбавителями были яичный желток и фосфаты или же молоко и фосфаты.

Левин и сотрудники нашли, что, хотя Т. foetus и переносили медленное охлаждение до —20 или до —76° в среде ЦППМ в присутствии 1 М глицерина, дальнейшего хранения при этих температурах они не переживали. Когда в среде понижалась концентрация других компонентов (кроме глицерина), эти простейшие лучше переживали хранение при низких температурах. Полученные результаты совпадали с предположением Лавлока, согласно которому защитное действие глицерина выражается в том, что он предотвращает изменение концентрации солей во время вымерзания воды. Фицджералд и Левин установили, что выживаемость была выше, когда трихомонад перед замораживанием уравновешивали с глицерином при температуре +24°, чем в опытах, в которых обработку глицерином производили при Когда среда ЦППМ была забуферена глицилглицином или триэтаноламином, микроорганизмы лучше переживали последующее замораживание в присутствии 1 М глицерина, чем в обычной среде ЦППМ. Вместе с тем применение фосфатного буфера Зёренсена подавляло рост трихомонад в среде ЦППМ и снижало их выживаемость после замораживания в присутствии глицерина. Чувствительность Т. foetus «О» к замораживанию зависела от фазы роста популяции, а также от состава среды. При замораживании при —21° в среде ЦППМ, содержащей вместо мальтозы глюкозу, в присутствии 1 М глицерина повреждения клеток были сильнее в начальной и логарифмической фазах роста, чем при достижении максимума и в течение нескольких часов после него. Максимум наступал спустя 28 час после посева культуры. Эти простейшие переживали замораживание, только если возраст культуры был не менее 20,3 час. Оптимальный возраст культур перед замораживанием для хранения в замороженном состоянии в течение 24 час составлял 37,7 час, а для культур, хранившихся 7—15 дней,— 32,3 час.

Левин и сотрудники изучали и другие факторы, которые могли влиять на защитные свойства глицерина в отношении Т. foetus во время замораживания и хранения при низких температурах и последующем оттаивании. Повреждение клеток во время хранения при низких температурах могло быть обусловлено медленным, но все же непрекращавшимся обменом веществ. Его можно было подавить с помощью таких антиметаболитов, как малоновая кислота, фтористый натрий и йод-ацетат натрия. Однако при добавлении этих веществ в глицеринсодержащую среду лишь небольшое число простейших переживало хранение в замороженном состоянии. Следовательно, либо указанные антиметаболиты оказывали токсическое действие, когда их концентрация повышалась в результате вымораживания воды, либо продолжающийся при —21° обмен веществ не был причиной гибели микроорганизмов. Лецитин, один из важных компонентов среды, в которой замораживали сперматозоиды быка и барана, защищал Т. foetus от повреждений во время инкубации при +37°, но не мог предотвратить постепенной гибели клеток при температуре —21°. Соотношение концентраций хлористого натрия и глицерина в данной среде в большой степени предопределяло выживаемость простейших после замораживания при —21°. Когда глицерин, разбавленный дистиллированной водой, добавляли в среду ЦППМ с таким расчетом, чтобы его конечная концентрация была 1 М, число жизнеспособных Т. foetus, восстановившихся при оттаивании через 24 час, достигало в среднем 96%. Если же глицерин разбавляли 0,85-процентным (0,15 М) раствором хлористого натрия, то выживало лишь 64% микроорганизмов. При концентрации же хлористого натрия 0,20 М число жизнеспособных клеток было еще меньше. Оптимальная концентрация глицерина во всех солевых растворах составляла 1,5 М.

Чувствительность Т. foetus к повреждениям при замораживании в глицеринсодержащей среде была наибольшей в начальных логарифмических фазах роста популяции. Устойчивость же была наибольшей во время максимального роста или после него, причем оптимальный возраст культуры для замораживания и продолжительного храпения при низких температурах составлял 32—37 час.

Влияние изменения концентрации солей на выживаемость обработанных глицерином замороженных трихомонад было сравнимо с тем, которое наблюдали в опытах на эритроцитах и сперматозоидах млекопитающих. Полученные результаты подтверждают положение, что буферное свойство глицерина, описанное Лавлоком, представляет собой один из важнейших факторов, действующих в биологических системах при температурах ниже точки замерзания. Различия в условиях, способствовавших выживанию замороженных клеток млекопитающих и замороженных трихомонад, возможно, отражают основные различия, существующие между отдельными типами клеток.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: