Полдж и Солтис пересмотрели существующие методы хранения трипаносом в замороженном состоянии, чтобы выяснить, нельзя ли повысить их выживаемость путем либо изменения состава суспензионной смеси, либо добавления глицерина или другого нейтрального соединения к соответствующей среде, либо изменения скорости охлаждения.
Предварительные опыты проводили на Trypanosoma brucei «О» в гепаринизированной крови, взятой у мыши на высоте инфекции. Пробы крови разбавляли 8 различными чистыми разбавителями и этими же разбавителями, но с добавлением 5, 10 или 20% глицерина. Готовили по три пробы трипаносом в каждом из 32 разбавителей (по 0,5 мл) и запечатывали их в обыкновенных пробирках. Первую пробу быстро замораживали путем погружения в смесь спирта и углекислоты с температурой —79°. Вторую замораживали в два приема, как рекомендуют Уэйпмэн и МакАллистер, погружая пробирки на 2 мин в смесь с температурой —15° и затем перенося их в баню с температурой —79°. Третью пробу медленно охлаждали до —79° так же, как в опытах на сперматозоидах быка. До температуры —20° скорость охлаждения составляла 2° в 1 мин, а затем (от —20 до —79°) она повышалась до 5° в 1 мин. После хранения пробирок в течение недели при —79° их оттаивали и исследовали содержимое под
микроскопом, чтобы выявить число погибших и живых микроорганизмов. Результаты исследования показали, что в растворе Альсевера большой процент трипаносом переживал быстрое замораживание при —79° в отсутствие глицерина, но в лошадиной сыворотке, растворе Рингера, цитрате натрия или в цитратно-желточной среде процент выживших организмов был ниже. Число микроорганизмов, у которых восстанавливалась подвижность после замораживания и оттаивания в отсутствие глицерина, уменьшалось при двухступенчатом охлаждении или при медленном охлаждении до —79°. И, наоборот, в средах, содержащих глицерин, наблюдалось плохое восстановление подвижности при быстром охлаждении и значительно лучшее — при медленном. Независимо от наличия или отсутствия в среде сыворотки около 80% микроорганизмов переживало медленное охлаждение, когда в раствор Альсевера или Рингера добавляли 5—10% глицерина, Двухступенчатое охлаждение давало менее удовлетворительные результаты, а при повышении концентрации глицерина до 20% во всех средах наблюдалось дальнейшее уменьшение числа выживших клеток.
Пробы трех штаммов Т. brucei, Т. rhodesiense «В», Т. congolense «V» и Т. gambiense «Н» — охлаждали до —79° в растворе Альсевера, содержащем сыворотку, и в той же самой среде с добавлением 10% глицерина. После двухмесячного хранения пробы оттаивали и вводили мышам. Вирулентность трипаносом не изменялась, судя по интервалу времени между прививкой и гибелью животных. После 8 месяцев хранения при —79° пробы Т. brucei были так же вирулентны, как и те, которые не подвергались замораживанию. Результаты дальнейших опытов показали, что чем выше температура, тем короче период, в течение которого Т. brucei переживали хранение в замороженном состоянии, особенно в среде, лишенной глицерина. Так, при отсутствии глицерина ни одна трипаносома не выжила после хранения в течение 3 дней при температуре —20°. Большая часть микроорганизмов погибла на следующий день. Когда в смесь добавили 10% глицерина, 40% трипаносом пережило 3 дня и 10% — 7 дней при температуре —20°. Максимальная продолжительность периода, в течение которого трипаносомы переживали хранение при —40° в присутствии 5 или 10% глицерина, была 14 дней. При температуре —79° и при любой концентрации глицерина 80% микроорганизмов сохраняли подвижность после хранения в течение 250 дней. Не изменилась устойчивость различных штаммов Т. brucei к лекарственным препаратам и антителам после 8 месяцев хранения при —79° в среде, содержащей 10% глицерина.
Практически проблема хранения живых трипаносом различных видов для дальнейшего экспериментирования была разрешена путем применения сред, содержащих 5 или 10% глицерина, медленного охлаждения до —79° и хранения при этой температуре. Полдж и Солтис испытывали также действие других нейтральных веществ на активность трипаносом при нормальной температуре и после кратковременного охлаждения до низких температур. Ацетамид был токсичным при любой температуре, а метанол оказывал токсическое и летальное действие при температуре ниже —30°. Трипаносомы, взвешенные в 0,94-процентном растворе хлористого натрия, содержащем 10% сыворотки, теряли подвижность и погибали при добавлении 0,75% глюкозы, 10% ксилозы или 15% сахарозы. Когда же их взвешивали в дистиллированной воде, содержащей 10% сыворотки и 7,5 или 10% сахаров, 90—100% микроорганизмов сохраняли высокую активность при комнатной температуре и после воздействия в течение 5 мин температуры —40°. Процент выживших клеток резко падал, когда взвесь в растворе сахаров быстро замораживали при температуре ниже —40°. В то же время 90% трипаносом, взвешенных в 10-процентном водном растворе лошадиной сыворотки, содержащем 10% глицерина, 7,5% ксилозы, 7,5% глюкозы или 10% сахарозы, переживали воздействие температуры —79°, если их предварительно замораживали на 2 мин при —20 или —30°.
Проведенные опыты особенно интересны в том отношении, что, как оказалось, трипаносомы лучше переносили сахара в отсутствие хлористого натрия и были более устойчивы к быстрому охлаждению, чем сперматозоиды быка. Губительное действие быстрого охлаждения до —79° в присутствии сахаров можно было предотвратить, проведя предварительно кратковременное охлаждение при температуре —20 или —30°. В настоящее время еще не ясен механизм защитного действия сахаров при данной методике охлаждения. В растворах не содержались электролиты, поэтому они не могли действовать в качестве буферных систем. В дальнейшем необходимо выяснить, можно ли осуществлять лиофилизацию трипаносом без потери ими жизнеспособности, приготовляя взвеси в среде, содержащей одно из тех соединений, которые предохраняют этих простейших от повреждений во время замораживания, и можно ли осуществлять высушивание при такой температуре, при которой повреждения во время возгонки льда в вакууме должны быть минимальными.