Если взять какой-нибудь белок, например сывороточный альбумин — белок нашей крови, добавить к нему крепкой кислоты и прокипятить, то он распадется на отдельные звенья — аминокислоты.
Приставка «амино» означает, что в состав аминокислот входит аминогруппа NH2. Белки относятся к высокополимерным веществам, состоящим из отдельных низкомолекулярных звеньев — мономеров. Аминокислоты в данном случае и будут мономерами.
Как только стало известно, что белки состоят из аминокислот, сразу возник вопрос: насколько отличаются друг от друга белки различных представителей живого мира — животных, растений, микробов, и сколько различных типов аминокислот встречается в белках? После кропотливой работы биохимикам удалось выяснить, что в состав белковых молекул, взятых от живых существ, находящихся на разных уровнях сложности организации, входят одни и те же 20 типов аминокислот, которые получили название «магических». Вот они: гликокол (глицин), аланин, серин, цистеин, цистин, метионин, треонин, валин, лейцин, изолейции, аспарагин, глутамин, лизин, аргинин, фенилаланин, тирозин, триптофан, гистидин, пролин и оксипролин.
Аминокислоты соединяются друг с другом при помощи пептидной связи. На рисунке — простейшая аминокислота гликокол, или глицин. Если она соединяется с другой аминокислотой, тоже глицином, аминогруппа NH2 одного глицина соединяется с кислотной (карбоксильной) группой глицина-соседа, и обе молекулы оказываются соединенными пептидной связью — СО—NH—. Несколько аминокислот, соединенных вместе, называется пептидом, так как они объединяются пептидными связями. Процесс соединения аминокислот происходит с отщеплением молекулы воды, а если добавить кислоту, то из пептидов вновь образуются аминокислоты. Процесс расщепления белков до аминокислот называется гидролизом.
Можно подсчитать число мономеров — аминокислот, входящих в состав данного белка, поделив его молекулярный вес на средний молекулярный вес одной аминокислоты. Молекулярный вес простых, хорошо известных нам веществ сравнительно невелик. Например, у хлористого натрия (поваренной соли) — около 59, у жирных кислот, входящих в состав животных жиров, — 300, средний вес аминокислоты порядка 120.
Самый «маленький», низкомолекулярный белок весит около 12 тысяч кислородных единиц. Поделив 12 тысяч на 120, получим 100. В молекулу белка-фермента рибонуклеазы входит, например, 124 аминокислоты. Есть белки, в состав которых входят тысячи и десятки тысяч аминокислот.
Для определения аминокислотного состава белков существует специальный метод — хроматография. Его разработал русский ученый М. Цвет. Он изучал состав зеленого пигмента растений — хлорофилла. Ученый знал, что все высокополимерные вещества (а у хлорофилла большой молекулярный вес) обладают способностью адсорбироваться, прилипать к поверхности тонкоизмельченных порошков. Из данных, которыми располагала физическая химия, можно было предположить, что у различных веществ способность к адсорбции может быть различной. Вот как описывал ученый свой опыт:
«Если раствор хлорофилла в петролейном эфире профильтровать через колонку адсорбента (я пользуюсь преимущественно карбонатом кальция, которым плотно набиваю узкую стеклянную трубку), то пигменты разделяются… образуя на колонке ряд узко окрашенных зон; более интенсивно адсорбирующиеся пигменты замещают более слабо адсорбирующиеся и оттесняют их дальше, вниз. Это разделение становится практически полным, если после пропускания раствора пигментов пропустить через колонку еще чистый растворитель. Подобно полосам светового спектра, на колонке из карбоната кальция разделяются различные компоненты смеси пигментов… которые можно теперь определять количественно и качественно. Такую колонку я назвал хроматограммой, а соответствующий метод — хроматографическим методом».
Это было замечательное открытие. В наше время хроматографический метод очень широко применяется в биохимических лабораториях.
Аминокислотный состав белков изучают так. После гидролиза определенного количества белка кислотой смесь входящих в его состав аминокислот в виде раствора наносят на хроматографическую бумагу. Затем бумагу помещают в специально подобранный растворитель, который начинает впитываться и медленно проходить к противоположному (от места нанесения смеси аминокислот) концу бумажного листа. Раствор захватывает молекулы аминокислот, которые вместе с ним проходят по бумаге, но различные типы аминокислот останавливаются в разных местах, чем и достигается отделение одних типов молекул от других аминокислот. Через несколько часов бумагу просушивают, а места расположения аминокислот обнаруживают с помощью специального «проявителя», который окрашивает их. Раз интенсивность окрашивания зависит от количества осевших аминокислот, то, измерив степень окраски каждого пятна, можно выяснить, сколько аминокислоты данного типа входит в состав изучаемого белка.
В последнее время хроматографический метод определения аминокислотного состава белков был доведен до такой степени совершенства, что его оказалось возможным полностью автоматизировать. Прибор — автоматический анализатор аминокислот — позволяет произвести полный анализ белка за 10—20 часов. В качестве адсорбента в нем используются ионообменные смолы, заключенные в стеклянную колонку, очень сходную с трубкой, которую применял Цвет в первых хроматографических анализах. Разница в тонкостях метода по сравнению с бумажной хроматографией состоит в том, что при помощи специального растворителя аминокислоты в разное время смываются с колонки, окрашиваются «проявителем» и автоматически учитываются специальными устройствами. Исследователь вечером «заряжает» колонку смесью аминокислот испытуемого белка, а утром получает готовые данные об абсолютном содержании каждой аминокислоты.
Как вы уже знаете, в состав белков входит сравнительно немного разных аминокислот — всего 20. Чем же объясняется тогда разнообразие белков различных организмов? Количеством аминокислот? Оказывается, нет, их последовательностью, порядком их расположения.
Хорошо известно, что смысл слова определяется порядком, последовательностью расположения букв. Представьте себе, что при типографском наборе произошла ошибка. Наборщик в слове «аминокислота» вместо буквы «к» вставил в строку букву «з». Получилось слово «аминозислота» — явная бессмыслица. Такую ошибку легко исправить. Если в этом же слове буква «а» случайно окажется замененной буквой «и», то «иминокислота» имеет совершенно другой смысл, так как иминокислоты существуют и отличаются от аминокислот тем, что вместо аминогруппы NH2 в их состав входит иминогруппа NH. Такая ошибка может изменить смысл целой фразы.
Было подсчитано, что разных сочетаний из 20 аминокислот может быть 1024, то есть астрономическое число — 10 с 24 нулями. Следовательно, разнообразие белков живой материи может быть практически бесконечным.
Изучение последовательности аминокислот в белках — очень трудная задача, и сейчас порядок расположения аминокислот изучен только в немногих, самых низкомолекулярных белках.
Для определения порядка чередования аминокислот биохимики также пользуются хроматографическим методом, но над белком проводится ряд сложных операций по его частичному расщеплению. Есть такие белки-ферменты, которые действуют только на пептидные связи. Их называют протеазами. Среди большого числа протеаз можно выбрать ферменты, действующие на связи между некоторыми аминокислотами (например, лизином, аргинином) и не затрагивающие других аминокислотных остатков. Следовательно, расщепление белка будет неполным, и в результате ферментативного гидролиза такими протеазами образуются низкомолекулярные фрагменты белковой молекулы — пептиды.
Следующая ступень — разделение пептидов, выделение каждого пептида в изолированном виде. Это проводится с помощью хроматографии примерно так, как описано выше. В каждом пептиде аминокислот меньше, чем в целом белке, и поэтому задача по определению порядка их чередования несколько облегчается.
Прежде всего, необходимо определить, какие аминокислоты концевые. Эту операцию проводят, используя способность аминокислот реагировать с различными химическими соединениями. Соединение аминокислоты с такими дополнительными реагентами придает ей некоторые характерные свойства, и это помогает исследователям отличать их от остальных аминокислот, располагающихся дальше до конца. Так, постепенно отщепляя аминокислоты, удается изучить последовательность их расположения в пептидах, а определив место каждого пептида в белковой молекуле, — аминокислотную последовательность и в самом белке. На это уходят годы напряженной работы.
Расположение аминокислот в общей полипептидной цепи — первичная структура белка. Однако такая последовательность еще не дает нам представления о структуре белковой молекулы, так как расположение аминокислот мы представляем себе на плоскости, на бумаге. Между тем каждая аминокислота имеет вполне определенную пространственную форму (конфигурацию). Следовательно, и составленный из аминокислот белок будет обладать некоторыми закономерностями расположения структуры в пространстве. Для исследования структуры белковой молекулы биохимики привлекли методы физики и химии.