Слияние мембран взаимодействующих гамет не только обеспечивает проникновение ядра сперматозоида в яйцо, но и служит фактором активации последнего.
Одновременно возникают разнообразные явления, препятствующие множественному проникновению сперматозоидов, или полиспермии, поскольку последняя ведет к нарушениям развития и даже к гибели зародыша. У морского ежа одним из следствий связывания сперматозоида оказывается кратковременное поступление Na+ в яйцо, которое, возможно, обусловлено действием акросомных белков на Na+-каналы. Увеличение концентрации Na+ в клетке ведет к ее деполяризации, связанной с резким изменением потенциала покоя. Перед оплодотворением потенциал покоя яйца морского ежа составляет около -70 мВ. Спустя несколько секунд после слияния мембран гамет он возрастает до +20 мВ. При этом плазматическая мембрана яйца теряет способность к взаимодействию с мембраной добавочных спермиев. Это явление называют быстрой блокировкой полисперлши. При сохранении потенциала покоя на уровне —70 мВ или при низкой концентрации Na+ в среде полиспермия не блокируется. Наоборот, при искусственном поддержании в неоплодотворенном яйце положительного потенциала взаимодействие гамет (и, следовательно, оплодотворение) становится неосуществимым.
Важным элементом молекулярного механизма активации яйца при оплодотворении служит изменение концентрации внутриклеточного свободного кальция ([Ca2+]i). Временное увеличение [Ca2+]i запускает сложный каскад сигналов, которые, по-видимому, регулируют разнообразные функции яйцеклетки вплоть до транскрипции генов. Полагают, что амплитуда, частота и локализация кальциевых сигналов может кодировать некую информацию, которая предопределяет нормальное развитие событий в одноклеточном зародыше.
До недавнего времени существовало представление о том, что у первичноротых животных (аннелиды, моллюски, членистоногие) и у вторичноротых (иглокожие, асцидии, позвоночные) механизмы формирования кальциевых сигналов существенно различаются. Полагали, что у первичноротых оплодотворение вызывает «кортикальную вспышку» — активацию ионных каналов плазматической мембраны яйца, благодаря которой происходит синхронный приток Са2+ из внешней среды по всей поверхности яйца. Этому механизму противопоставляли выведение эндогенного Са2+, из внутренних депо яйцеклетки вторичноротых, которое начинается в точке проникновения сперматозоида и распространяется в виде волны по всему яйцу. Однако изучение динамики концентрации ионов кальция с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа показало необоснованность такого противопоставления. Оказалось, что и у морских ежей в момент связывания спермия с яйцом в кортикальном слое последнего происходит почти мгновенный подъем [Са2+] в результате открытия Са2+-каналов оолеммы. Са2+-волна, независимая от внешних источников кальция, наблюдалась лишь через некоторое время после быстрого подъема [Са2+].
Описаны два главных типа кальциевых волн в оплодотворенных яйцах. Так, у иглокожих, рыб и амфибий обнаруживается единичная кальциевая волна. У млекопитающих и асцидий наблюдается серия многократных (12-25 раз) подъемов [Ca2+]i. Природа этих осцилляций не вполне ясна. Предполагается, что в сперматозоидах млекопитающих имеется особый осцилогенный фактор. Действительно, эффект кальциевой осцилляции можно получить в опытах по микроинъекции сперматозоида в яйцо или после инъекции в яйцо фактора, экстрагированного из сперматозоида.
Исследование особенностей динамики содержания ионов Са2+ после оплодотворения у новых объектов обнаруживает большее разнообразие типов, чем это предполагалось ранее. Например, у немертин вслед за возникающей через 30 с после контакта со сперматозоидом «кортикальной вспышкой», и характерной для первичноротых, начинается кальциевая осцилляция, типичная для млекопитающих. Эта осцилляция обусловлена периодическим высвобождением Са2+ из внутриклеточного депо, поскольку она продолжается и при перенесении оплодотворенных яиц немертины в бескальциевую воду.
К настоящему времени подробно исследованы молекулярные механизмы высвобождения Са2+ из запасов яйцеклетки у вторичноротых. Ведущим событием здесь является активация G-белков, которые, в свою очередь, активируют фосфолипазу С. Этот фермент расщепляет связанный с мембраной липид фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат на диацилглицерол и инозитолтрифосфат (ИТФ). ИТФ способствует высвобождению внутриклеточного запаса Са2+, тогда как диацилглицерол, активируя протеинкиназу С, усиливает функцию Na+/H+-насоса. Результатом этой активации является откачка Н+ во внешнюю среду, подкисление которой отмечалось уже первыми исследователями физиологии оплодотворения, описавшими выделение «кислоты оплодотворения». Повышение внутриклеточного pH, которое обусловлено активацией Na+/H+-насосов, служит необходимым условием для стимуляции синтеза ДНК, синтеза белков, для активации систем внутриклеточного транспорта. Как полагают в неоплодотворенной яйцеклетке имеется фактор, ингибирующий ключевой, или «критический» белок (например, один из белков рибосомы), подавление функциональной активности которого ведет к угнетению фундаментальных клеточных процессов. Гипотеза «критического белка» допускает, что имеется пороговое значение pH, превышение которого ведет к диссоциации комплекса «ингибитор/критический белок» и к активации этого белка. Эта гипотеза согласуется с данными о том, что у морского ежа клеточный транспорт активируется уже через 5 мин после оплодотворения, а репликация ДНК — через 25 мин.
Кроме инозитол-индуцируемого пути (IICR — inositol-induced Са release) в ооцитах ряда животных обнаружен и иной механизм высвобождения кальция, который идентифицируется по специфическим, чувствительным к алкалоиду рианодину, рецепторам. В этом случае высвобождение эндогенного Са2+ индуцируется ионами кальция (CICR— Ca-induced Са release).
Повышение концентрации Са2+ в яйце вызывает экзоцитоз кортикальных гранул. Роль Са2+ в экзоцитозе была продемонстрирована в опытах in vitro на препаратах кортекса яйца, а также в опытах, где ингибитор высвобождения Са2+ прокаин подавлял активацию яйца, тогда как облегчающий транспорт Са2+ ионофор А23187, напротив, активировал неоплодотворенные яйца. При очевидной доказанности роли ионов кальция в экзоцитозе кортикальных гранул пока еще нет ясного понимания молекулярных механизмов этого сопряжения. Поскольку между увеличением концентрации Са2+ и началом экзоцитоза кортикальных гранул существует длящаяся около 8 с пауза, сопряжение этих процессов, по-видимому, опосредовано каким-то промежуточным звеном.
Содержимое кортикальных гранул попадает в перивителлиновое пространство, ограниченное плазматической мембраной яйца и желточной оболочкой. Экзоцитоз в яйцах морского ежа начинается примерно через 25 с после слияния гамет и длится около 40 с, распространяясь по поверхности яйца от точки вхождения сперматозоида. Среди разнообразных компонентов кортикальных гранул имеются сульфомукополисахариды, протеазы и карбогидразы. Сульфомукополисахариды, связывая воду, сильно разбухают, вследствие чего желточная оболочка заметно приподнимается над поверхностью яйца, образуя оболочку оплодотворения. Протеазы разрушают некоторые белки оболочки и рецепторы биндина. Благодаря этому оболочка оплодотворения теряет способность к первичному связыванию сперматозоидов. Карбогидразы, отщепляя некоторые углеводные компоненты желточной оболочки, способствуют ее задубливанию. Все эти процессы — образование оболочки оплодотворения, ее задубливание и утрата рецепторов биндина, — составляют элементы медленной блокировки полиспермии.
Кортикальные гранулы имеют различные размеры и содержат разные вещества. У морского ежа наблюдается строго координированная последовательность экзоцитоза разных видов кортикальных гранул, что хорошо видно на примере формирования гиалинового слоя на поверхности зародыша. Гиалиновый слой «цементирует» бластомеры и, будучи фактором ограничения их подвижности, играет важную роль в морфогенетических процессах. Главным компонентом гиалинового слоя является белок гиалин, содержание которого в неоплодотворенном яйце достигает около 0,1% общего белка. Кроме гиалина в этом слое обнаружены гомодимерный гликопротеин эхинонектин и другие белки. Все эти компоненты выводятся на поверхность яйца из кортикальных гранул в определенной последовательности. Примерно через 20 с после активации яйца выводится гиалин и антиген 1В10, через 2 мин — антиген 8dll, а эхинонектин через 5 мин. Такая последовательность выведения компонентов, по-видимому, и определяет многослойность гиалинового слоя.