Классические методы иммунного анализа (РА, РП), предназначенные для обнаружения антигенов (Аг) или антител (Ат), основаны на учете второй стадии их взаимодействия, приводящей к образованию агглютинага или преципитата.
Для визуального обнаружения преципитата необходимы значительные концентрации взаимодействующих реагентов и длительное время: результаты (РА, РП, РИД) учитываются качественно либо полуколичественно. Преимущество классических методов заключается в их простоте и возможности применения в плохо оснащенных лабораториях, поэтому их до сих пор широко используют, несмотря на очевидные недостатки.
Новые методы гомогенного и гетерогенного иммуноанализа позволяют регистрировать реакцию Аг — Ат на первой фазе их взаимодействия, что отвечает требованиям экспресс-анализа. При твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА) в качестве активных групп реагентов-маркеров используют ферменты, радиоизотопы, флюорохромы, хелаты редкоземельных элементов и др. Образовавшийся иммунный комплекс регистрируют по обнаружению маркера, что на несколько порядков повысило чувствительность иммунологических методов и расширило возможность их применения в различных областях медицины, ветеринарии и биологии.
Принцип ТИФА. Твердофазный иммуноферментный анализ представляет собой диагностический тест для быстрого обнаружения микроорганизмов, их антигенов, токсинов в жидкой среде, а также для выявления антител.
В основе лежит применение иммуносорбента на твердой фазе для фиксации гомологичного Аг или Ат с последующим присоединением к иммунному комплексу антител, меченных ферментом. Фермент обнаруживают с помощью химической реакции превращения энзимных субстратов в окрашенные или флюоресцирующие соединения либо используя хемилюминесценцию.
Результаты регистрируют визуально, а также с помощью технических средств (фотометром, флюориметром, хемилюминометром).
Материалы и оборудование. 1. Полистироловые микротитровальные планшеты для серологических реакций или нитроцеллюлозные фильтры (НЦФ) с порами диаметром 0,22…0,45 мкм. Используют в качестве твердой фазы. 2. Карбонат-бикарбонатный буфер (КББ) (pH 9,6). Состоит из 1,59 г Na2CO3H 2,93 г NaHCO3 растворенных в 1 л дистиллированной воды. Раствор хранят при комнатной температуре не более 2 нед. Применяют для абсорбции иммуноглобулина на твердом носителе. 3. Калий-фосфатный буфер 0,01 М (КФБ) (pH 7,2). Готовят из 1 М основного раствора (К2НРO4 — 136,1 г, NaCl — 5,8 г, дистиллированной воды до 1000 мл) и доводят pH 1 М КОН. Применяют для приготовления рабочих разведений исследуемого материала и иммуноглобулинов. Для разведения конъюгатов или отмывания иммуноглобулинов к раствору добавляют Твин-20 до получения 0,5%-й концентрации КФБТ. 4. Иммуноглобулин для приготовления иммуносорбента. 5. Бычий сывороточный альбумин (БСА). Используют для приготовления рабочего разведения конъюгата. 6. Конъюгат. Это иммуноглобулин, меченный ферментом к возбудителю, или антивидовой конъюгат. 7. Сыворотка, специфичная искомому антигену, или иммуноглобулин. 8. Субстрат для выявления активности фермента. С целью обнаружения фермента пероксидазы (ПХ) используют О-фенилендиамин, 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК), О-дианизидин. Щелочную фосфатазу выявляют с помощью хромогенного субстрата 4-нитрофенилфосфата или флюорогенного соединения 4-метилумбеллиферилфосфата. При использовании фермента пенициллиназы применяют субстратную смесь иодинола и пенициллина. 9. Стоп-реактивы для остановки реакции расщепления фермент-субстрата. При использовании О-дианизидина или О-фенилендиамина стоп-реактивом является 18%-й раствор НСl, для 5-АСК или 4-нитрофенилфосфата — 4%-й NaOH.
Приготовление иммуносорбента.
1. Иммуноглобулин (иммуносорбент), предназначенный для сорбции на лунках планшета, разводят КББ (pH 9,6) до рабочей концентрации: в каждую лунку вносят по 0,1 мл.
2. Планшеты помещают на 3 ч в термостат при 37 °С или выдерживают 18…20 ч в холодильнике для сорбции иммуноглобулина на планшетах.
3. Пластинки промывают КФБ с 0,5%-м Твином-20 3 раза по 1…2 мин.
4. Лунки заполняют 1%-м раствором БСА. Планшеты оставляют на 1 ч при 37 °С, а затем промывают и высушивают.
Приготовленный иммуносорбент хранят при 4 °С до момента использования.
Приготовление диагностических реактивов и препаратов.
1. Конъюгат, предварительно оттитрованный, разбавляют до рабочего разведения КФБТ.
2. Иммуноглобулин или антисыворотку для постановки непрямого варианта ТИФА доводят до рабочего разведения КФБ (pH 7,2).
3. Рабочие растворы ферментного субстрата готовят непосредственно перед использованием.
Рабочий раствор О-фенилендиамина готовят на нитратном буфере (1,92%-й раствор лимонной кислоты — 120 мл, 3,5%-й раствор двузамещенного выветренного фосфата натрия — 100 мл, pH 5,0 доводят одним из растворов) для получения концентрации 0,4 мг/мл. К полученному раствору добавляют Н2O2 до конечной концентрации 0,006 % (0,02 мл 3%-го Н2O2 на 10 мл раствора субстрата).
Рабочий раствор О-дианизидина готовят, используя следующую смесь: 0,6 мл 1 М КФБ (pH 6,0); 0,6 мл 0,3%-го раствора Н2O2, 58,8 мл дистиллированной воды. К этой смеси добавляют по каплям 0,5 мл 1%-го раствора О-дианизидина в метаноле.
Рабочий раствор 5-АСК готовят по следующей схеме: 80 мг субстрата растворяют в 100 мл дистиллированной воды, подогревают до 70 °С, охлаждают и с помощью 4%-го раствора NaOH доводят до pH 6,0. Непосредственно перед использованием в 9 мл раствора вносят 1 мл 0,05%-го раствора Н2O2.
Рабочий раствор 4-нитрофенилфосфата готовят на 10%-м диэтиловом буфере (97 мл диэтаноламина растворяют в 800 мл дистиллированной воды, добавляют 0,5 мл азида натрия; pH устанавливают 7%-й хлороводородной кислотой до 9,8; общий объем доводят дистиллированной водой до 1000 мл). Хранят в темном месте при 20 °С. Непосредственно перед использованием 5 мг субстрата растворяют в 5 мл 10%-го диэтилового буфера.
Рабочий раствор субстратной смеси с целью обнаружения пенициллиназы готовят, разводя иодинол забуференным физиологическим раствором (pH 7,2) 1 : 10. Непосредственно перед использованием в раствор иодинола вносят пенициллин до конечной концентрации 0,1 мг/мл.
ТИФА для выявления антигенов. Разработаны два варианта ТИФА.
Прямой вариант
1. В каждую лунку планшета с сорбированным иммуноглобулином вносят по 0,1 мл исследуемой пробы. В контрольные лунки закапывают КФБ.
2. Планшет на 1 ч помещают в термостат при 37 °С.
3. Исследуемый материал удаляют, а лунки трехкратно промывают КФБТ.
4. В резервуары вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата. Планшеты инкубируют при 37 °С в течение 1 ч.
5. После промывания закапывают по 0,1 мл свежеприготовленного раствора субстрата. Пластины выдерживают 20…30 мин в полной темноте.
6. Для остановки химической реакции в каждую лунку вносят по 0,1 мл стоп-реактива.
Непрямой вариант
1. В резервуары планшета, сенсибилизированного иммуноглобулином к искомому биологическому агенту, вносят по 0,1 мл исследуемого материала; в контрольную лунку — КФБ.
2. Исследуемый материал удаляют после выдерживания планшета при 37 °С в течение 1 ч. Резервуары промывают КФБТ.
3. Закапывают по 0,1 мл специфического иммуноглобулина или сыворотки. После инкубации и промывания в лунки вносят по 0,1 мл рабочего разведения антивидового иммуноконъюгата или конъюгата на БСА.
4. Планшет инкубируют при 37 °С в течение 1 ч, промывают и вносят ферментный субстрат, а затем при необходимости стоп-реактив.
ТИФА для выявления специфических антител.
Используют те же материалы, растворы и реагенты, что были указаны выше. Иммуносорбент готовят по следующей методике.
1. Стандартные антигены различных микроорганизмов разводят до рабочей концентрации КФБ (pH 7,2).
2. В каждую лунку планшета, покрытую иммуноглобулином к искомому антигену, вносят по 0,1 мл рабочего разведения гомологичного Аг.
3. Планшеты выдерживают при 37 °С в течение 1 ч, трижды промывают КФБТ. Затем вносят по 0,1 мл парных разведений исследуемых сывороток, а в контрольные лунки — сыворотку, не содержащую специфических Ат.
4. После инкубации и промывания в резервуары вносят по 0,1 мл рабочего разведения антивидового конъюгата или конъюгата на основе БСА. Планшет инкубируют при 37 °С в течение 1 ч, затем лунки промывают.
5. В лунки вносят раствор ферментного субстрата и через 20…30 мин стоп-реактив.
Учет результатов. Результаты ТИФА учитывают визуально. В положительном случае содержимое лунок окрашивается; на нитроцеллюлозном фильтре появляются точки коричневого цвета различной интенсивности, в контроле окраска отсутствует.
При необходимости количественного учета используют технические средства.
Практическое использование. Применяют ТИФА для диагностики зооантропонозов (сибирской язвы, сапа и бруцеллеза). Одним из первых в нашей стране разработал иммуноферментные тест-системы и апробировал их коллектив исследователей, который возглавлял Л. Ф. Зыкин.
Для подтверждения диагноза ИФА был успешно применен в небольшом сибиреязвенном очаге (А. Т. Яковлев, 1984). В качестве тест-объектов использовали содержимое пунктатов язв трех человек, больных кожной формой сибирской язвы; смывы с ножа и топора, которыми разделывали туши овец, павших от сибирской язвы; 2 пробы почвы с места вынужденного забоя; 6 проб кожи скота из неблагополучного хозяйства. Сибиреязвенный антиген был обнаружен в двух пробах: пунктате кожной язвы больного В.; в смывах с ножа и топора. При постановке биопробы у больного В. изолировали культуру В. anthracis и идентифицировали ее. Все три случая впоследствии были подтверждены бактериологически.
В 1984—1985 гг. сапная тест-система была успешно апробирована при обследовании лошадей, импортированных из Монголии. Материал от забитых на Улан-Удэнском мясокомбинате лошадей параллельно исследовали на сап иммуноферментным методом и в РИГА. Проба из легких одной лошади дала положительный результат на сапный антиген: в ТИФА в титре 1: 640 и в РИГА — 1 : 160. Позже от этой лошади была изолирована чистая культура В. mallei (Б. И. Мельников и соавт., 1987).
В 1983—1985 гг. была проведена оценка значения ИФА для лабораторной диагностики бруцеллеза в Волгоградском и Ставропольском противочумных институтах совместно с рядом научно-практических учреждений Узбекистана, Туркменистана и Краснодарского края (Л. Ф. Зыкин, И. Ф. Таран, В. С. Рыбкин, О. Н. Лопаткин, А. Н. Ахмедов, К. Д. Джалилов, В. М. Костюковский идр.). Полученные научные данные послужили основой методических рекомендаций «Иммунологические методы исследования в диагностике бруцеллеза» (утв. Министерством здравоохранения Узбекистана в 1986 г.). Для иммунизации кроликов и баранов с целью получения сывороток и сенсибилизации пластин использовали водно-солевые экстракты бруцелл трех основных видов, а также живую вакцину ВА-19. Иммунопероксидазные конъюгаты готовили методом периодатного окисления. Использованные для сравнения реакции Райта и Хедцльсона выполняли в соответствии с действующими методическими указаниями. РИГА с целью обнаружения антигена ставили с экспериментальными сериями иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума производства Среднеазиатского противочумного института, а антител — с коммерческим диагностикумом бруцеллезным сухим. Работа была проведена в ряде районов Краснодарского края России, Бухарской области Узбекистана, Марыйской области Туркменистана.
Чувствительность бруцеллезных ИПК с клетками В. melitensis, В. abortus, В. suis составляла 1 ∙ 103…1 ∙ 104 м. т./мл.
Возбудитель эпидидимита баранов B. ovis не был выделен в ТИФА (что соответствует данным литературы). Водорастворимые антигены бруцелл обнаруживали в ТИФА в концентрации 50 нг/мл.
Конъюгаты оказались высокоспецифичными; из 167 штаммов различных гетерогенных микроорганизмов лишь одна культура Y. enterocolitica 09 дала положительные результаты: тесное антигенное родство бруцелл и иерсиний давно установлено.
Из 305 проб от ягнят в ТИФА было получено 12,4 % положительных результатов, а в РИГА — 10,4 %. Чаще антиген выявляли в суспензиях селезенок (11,2 %), чем в содержимом желудков (2,9 %). На Бухарском мясокомбинате исследовали содержимое 100 желудочков плодов овцы (каракульчат) и 13 смывов со шкурок: антиген обнаружен только в первом материале. Также в ТИФА был обнаружен бруцеллезный антиген в 3 пробах мяса из 11.
Молоко в ТИФА следует исследовать либо неразведенным, либо в низких разведениях.
В Бухарской области Узбекистана бруцеллезный антиген обнаружили с помощью ТИФА в брынзе и чакке (кисломолочный продукт), продававшихся на рынке. Эти результаты с несомненностью свидетельствовали о неблагополучии в животноводческих хозяйствах.
Для того чтобы исключить возможность неспецифических результатов, сравнивали данные с результатами обследования материала из благополучного региона.
В Краснодарском крае было исследовано на бруцеллезный антиген 152 пробы молока из различных хозяйств. Только в одном случае в ТИФА обнаружили антиген бруцелл в молоке непривитой коровы, что, вероятнее всего, свидетельствовало о заболевании. Такой низкий показатель (0,6 %) позитивных результатов свидетельствовал об относительном эпизоотологическом благополучии в обследованных хозяйствах края.
В сыворотках крови вакцинированных сельскохозяйственных животных антигены бруцелл обнаруживали чаще и в больших концентрациях, чем в молоке; такая же закономерность характерна при исследовании сывороток людей. Поэтому на наличие антигенов бруцелл следует исследовать в первую очередь сыворотку крови (А. Н. Ахмедова, 1990).
При исследовании сывороток крови крупного и мелкого рогатого скота в Бухарской области была выявлена высокая доля (%) серопозитивных животных как в РИГА, так и в ТИФА. Антитела с помощью ТИФА обнаруживали более часто и в более высоких титрах, чем в РИГА. Кроме того, отмечалась некоторая тенденция к соответствию частоты обнаружения антител и их напряженности эпизоотологическому состоянию по бруцеллезу.
Наибольшее обнаружение (%) в молоке антител к бруцеллезным антигенам отмечено в Алатском изоляторе, где животные находились в карантине по бруцеллезу; наименьшее — в пробах из Краснодарского края, где, как ранее отмечали, реже регистрируется бруцеллез животных. Эти данные подтверждают целесообразность использования ТИФА для определения антител в молоке.
Были проанализированы результаты серологического обследования 978 человек, проживающих на различных территориях, неблагополучных по бруцеллезу. Эпидемиологические и клиниколабораторные данные позволили разделить обследованных на три группы: 1) больные острым, подострым бруцеллезом и лица с обострением хронических форм (555); 2) положительно реагирующие на бруцеллин (388); 3) контрольная группа: а) люди, проживающие в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, не имеющие клинических проявлений; б) здоровые доноры (80). Полученные данные подтверждают преимущество ИФА перед стандартными тестами в диагностике бруцеллеза у больных и положительно реагирующих лиц, что предопределяет перспективность этой реакции при эпидемиологическом контроле.
Была разработана (Э. М. Плотникова и соавт., 2003) иммуноферментная тест-система для контроля иммунного статуса животных по бруцеллезу и индикации возбудителя в объектах окружающей среды. При помощи данного ИФА-теста антитела из крови вакцинированных животных вакциной из штамма 82 выявляли в 2,5 и 1,5 раза чаще, чем в РСК и РА соответственно. Кроме того, с помощью ИФА бруцеллезный антиген обнаруживают в течение 6…7 ч в пробах воды при концентрации 100 м. т./мл, зернофуража — 1000 м. т./г, грубых кормов — 10 000 м. т./мл. Сконструированы (С. Saegerman et al., 2004) и успешно испытаны тест-системы на основе моноклональных антител и белка G для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в Бельгии.
В настоящее время в РФ выпускаются коммерческие бруцеллезные тест-системы, и ТИФА является официальным методом, который вошел в инструкцию по бруцеллезу, утвержденную МСХ РФ. Иммуноферментные тест-системы для диагностики многих зооантропонозов производятся рядом отечественных фирм: «Литех», «Биоком», «Вектор» и др.
Таким образом, ТИФА можно использовать как лабораторный тест при диагностике бруцеллеза.