Факультет

Студентам

Посетителям

Построение генетических карт бактериофагов

У большинства организмов невозможно построить генетическую карту, взяв за единицу один ген, так как различные гены объединены в несколько групп сцепления.

Однако у фагов Т4 и Т2, у которых уже удалось нанести на карту ряд генов, по-видимому, имеется лишь одна группа сцепления; генетически эти фаги ведут себя, как организмы с одной гаплоидной хромосомой. Вид получаемой генетической карты, конечно, зависит от штамма бактерии, выбранной в качестве хозяина. Мы уже показали, что стерильные пятна, образуемые мутантами r при заражении Е. coli В, имеют совсем не такой вид, как при заражении Е. coli К. Таким образом, на генетической карте, полученной при выращивании фага на определенном штамме бактерии-хозяина, будут отражены лишь те локусы, которые вызывают заметные изменения фенотипа в данных условиях среды.

При построении генетической карты фага применяются, в сущности, те же приемы, которые были использованы при построении генетических карт дрозофилы или гороха. Штамм дикого типа фага выбирается произвольно. Затем при заражении определенного штамма Е. coli выделяют мутантов, отличающихся по каким-либо хорошо заметным фенотипическим признакам, например по морфологии пятен. «Скрещивая» мутантов и наблюдая, какой процент частиц в дочернем поколении отличается от мутантных родительских частиц, можно определить относительное расположение двух мутантных локусов в «хромосоме» фага. Конечно, у фагов нельзя провести настоящее скрещивание; вместо этого бактериальные клетки заражают смесью двух определенных фагов, после чего внутри клетки происходит рекомбинация на основе какого-то еще не выясненного процесса, который напоминает перекрест, наблюдаемый у высших организмов. Как указывалось выше, при обычном перекресте возможны рекомбинанты двух типов: рекомбинант дикого типа и двойной рекомбинант, содержащий оба мутантных локуса. Было обнаружено, что у фагов такого реципрокного перекреста не происходит; при каждом акте рекомбинации образуется лишь один из рекомбинантных типов (может быть, это происходит в результате удвоения «с переменой матриц»). Однако, поскольку одна фаговая частица дает сотни дочерних частиц и поскольку вероятность образования рекомбинантов того и другого типа, по-видимому, одинакова, можно применять обычные статистические методы.

Бензер в течение последних лет составил карты для многих мутантов r фага Т4. Его исследования представляют собой первую реальную попытку определить наименьшие возможные границы участка при рекомбинации и стремятся «привязать карту к местности» (употребляя выражение, приписываемое Бензером Дельбрюку). Выявление мутантов у бактериофагов и нанесение их на карту зависит от нескольких факторов, в том числе от чувствительности методики выявления мутантов и наличия некоторых мутаций, связанных с выпадением (делецией) значительного участка карты. Мы увидим в дальнейшем, что последний фактор позволил Бензеру сгруппировать многие точковые мутации в «семейства», что сильно уменьшило число необходимых «скрещиваний».

В любой популяции фага Т4 время от времени возникает спонтанная мутация, приводящая к образованию в культурах бактерии-хозяина Е. coli на агаре стерильных пятен типа r. Поскольку число фаговых частиц на поверхности агаровой среды в чашке Петри может достигать астрономических величин, присутствие одного мутанта r на 109 частиц легко обнаружить по внешнему виду стерильного пятна. Когда накоплено достаточное число таких мутантов, их можно разбить на три подгруппы, заражая ими Е. coli К. При помощи этого приема можно различать фаги: 1) дающие пятна типа r и при заражении Е. coli К, 2) дающие пятна дикого типа и 3) совершенно неспособные расти на штамме К. Эти три группы, получившие названия соответственно типов rI, rII и rIII, можно расположить в линейном порядке, произведя «скрещивания» путем смешанной инфекции. Схема показывает, что рекомбинации между типами rII и III наблюдаются чаще, чем между типами rII и rI; на основании этого делается обычный вывод о линейном расположении «генов».

Бензер выбрал для генетического анализа в основном участок rII. Мутанты rII довольно легко обнаружить, поскольку они совсем не растут на штамме К, и поэтому фенотипически их легко выявить. Это позволило без труда отобрать тысячи мутантов, что было необходимо для создания генетической карты.

В дальнейшем мутанты rII были разбиты на подгруппы на основе цис-транс-теста. Вспомним, что этот метод генетического анализа помогает определить, относятся ли два мутанта, имеющие одинаковое фенотипическое выражение, к одной функциональной единице наследственности или к двум разным единицам, взаимодействие которых обусловливает появление данного изменения. При обсуждении генов lozenge у дрозофилы мы отмечали, что три тесно сцепленных генетических локуса оказались частями одной и той же генетической единицы, поскольку скрещивания между двойными гетерозиготами, у которых оба мутантных локуса лежат в одной из парных хромосомных нитей (т. е. при цис-конфигурации), дают рекомбинантов дикого типа, тогда как скрещивания между двойными гетерозиготами в транс-конфигурации не дают таких рекомбинантов. Получение нормального фенотипа при цис-конфигурации можно объяснить, допустив, что одна неизмененная нить хромосомы обеспечивала единицу физиологической функции в достаточной мере, чтобы потребности организма были удовлетворены, даже несмотря на присутствие «нефункционирующей» хроматиды.

Хотя генетический материал фагов функционирует так, как будто организм гаплоидный, однако к ним можно применить цис-транс-тест, поскольку смешанное заражение двумя мутантами как бы симулирует обычное для высших организмов состояние диплоидности. Таким образом, если мутант r ввести в клетку бактерии-хозяина Е. coli К вместе с частицей фага дикого типа, то клетки лизируются и освобождают частицы фагов обоих родительских типов. Присутствие частиц дикого типа, возможно, обеспечивает функцию, отсутствующую у мутанта (мутация rIII — рецессивная).

Предполагается, хотя соответствующих опытов поставлено не было, что по той же причине при смешанном заражении частицами дикого типа и двойного мутанта г, несущего обе мутации в одной нити, в потомстве получатся частицы обоих типов. Однако если для заражения используют два мутанта r, то лизис бактерии-хозяина и появление потомства фага произойдут лишь в том случае, если эти два мутанта лишены разных функциональных единиц. Если два мутанта после смешанной инфекции не лизируют Е. coli К, то делается вывод, что обе мутации относятся к одной функциональной группе, которую Бензер назвал цистроном (название это происходит от названия применяемого теста). Если же они дополняют друг друга и вызывают лизис, то делается вывод, что мутации относятся к разным цистронам. При помощи этой методики Бензер разделил мутантные участки rII на две различные группы — цистроны А и В. Можно представить себе, что каждый фермент, относящийся к группе ферментов, участвующих в синтезе фага, образование которых индуцируется у бактерий лишь при заражении бактериофагами, представлен отдельным цистроном.)

В настоящее время ясно, что для нанесения на карту большого числа мутантных локусов, даже после такого их подразделения, потребовалось бы провести огромное множество скрещиваний. Бензер использовал то обстоятельство, что появление некоторых мутантов, по-видимому, связано не с точковой мутацией, а с изменением более значительного участка. Эти необычные мутанты выявляются потому, что при скрещивании их с другими мутантами (дающими при скрещивании друг с другом рекомбинантов дикого типа) рекомбинантов дикого типа обнаружить не удается. Используя мутанты типа делений для проведения дальнейшего анализа внутри каждого из двух цистронов, Бензер упростил задачу нанесения мутантов на карту, так как при этом необходимо было производить скрещивания во всех комбинациях лишь между теми мутантами, которые попали в участки, ограниченные одной или другой делецией, а не между всеми мутантами, относящимися к каждому цистрону. Мы не будем подробно описывать эту часть работы по построению карты. Несмотря на указанные упрощения, работа была необычайно трудоемкой. Схематичная карта построена на основе данных по перекресту для 923 мутантов r. Помимо распределения «точковых» мутаций, на ней показана локализация различных мутаций типа делеций (горизонтальные полосы или линии), которые так сильно помогли построению карты. На карте отражено также указание Бензера о том, что многие независимые мутации оказались локализованными в одном и том же месте. Другими словами, некоторые участки генетического материала в области rII, по-видимому, обладают значительно более высокой мутабильностью, чем другие. Слово «по-видимому» здесь употреблено намеренно, так как необходимо учитывать, что выявление мутанта производится при помощи теста на его фенотип. Например, мы видели, что некоторые мутанты r ведут себя на Е. coli К так, как если бы мутация при выращивании на этом хозяине была детальна для фага. Другие ведут себя как фаги дикого типа. Конечно, эти типы мутаций не относятся к участку rII, о котором только что шла речь. Однако мы не можем предположить (и это предположение частично подтверждается некоторыми наблюдениями), что некоторые вещества, синтез которых контролируется одним или другим цистроном участка rII, обладают какими-то более важными структурными особенностями, чем другие. Мутации, ведущие к изменению функционально менее важных частей в структуре фагового белка, вероятно, будут обнаруживаться реже, поскольку их влияние на характерные особенности стерильных пятен мутанта г, растущего на Е. coll К, может быть выражено слабее по сравнению с влиянием мутаций, обусловливающих полную неспособность расти на этом штамме; последние вызывают такое сильное изменение в химии фагового белка, которое совершенно подавляет его функцию.

Цистрон — термин, предложенный Бензером для обозначения функциональной единицы, — безусловно сложная структура. Он содержит много различных генетических субъединиц, о чем свидетельствует ряд отдельных локусов, расположенных внутри занимаемого им отрезка, которые можно обнаружить при рекомбинации. Бензер (который, так же как и Левинталь, пришел к биологии от физики) придумал для субъединиц цистрона названия, звучащие, как физические термины. Наименьшую элементарную единицу (в одном измерении), которая при рекомбинации может обмениваться, но не разделяться, он назвал реконом. Наименьший компонент цистрона, который, изменяясь, дает начало мутантной форме организма, он назвал мутоном.

Размер рекона можно определить путем выделения и нанесения на карту такого большого числа мутаций, связанных с определенным участком, что расстояние между отдельными локусами приблизится к неделимой единице. Таким образом, рекон — это эмпирическая единица, которая меньше или равна минимальному (но не равному нулю) расстоянию между двумя мутациями. Длину мутона определяют, устанавливая разность расстояний на карте между тесно сцепленными группами мутаций. «Длина» мутации 2 равна разности между длинным отрезком и суммой двух коротких отрезков. Длину мутона можно также измерить, определив максимальное число мутацйй, разделяемых путем рекомбинации, которое может уместиться в определенном участке карты.

Необходимо подчеркнуть, что генетические единицы, предложенные Бензером, — чисто условные рабочие единицы как по своему значению, так и по происхождению. Они необходимы для того, чтобы подчеркнуть сложность термина «ген», поскольку они позволяют провести четкие различия между различными аспектами гена как единицы рекомбинации, мутации и функции. Еще слишком рано говорить о том, что наблюдения, сделанные на фагах, можно прямо перенести на высшие организмы; однако эти данные создают рациональную основу для понимания таких явлений, как псевдоаллелизм. Еще важнее то, что благодаря установлению высокой плотности расположения генов на карте и сделанным на этой основе выводам о размере рекона в настоящее время можно обсуждать химическое строение и генетические данные на одном и том же материале. Предположив, что известны молекулярная длина нити ДНК фага (возможно, что она соответствует 80000 пар нуклеотидов в двойной спирали) и общая «генетическая» длина (вероятно, порядка 800 единиц рекомбинации), Бензер мог допустить, что одна пара нуклеотидов соответствует примерно 0,01. единицы рекомбинации. Поскольку это расстояние того же порядка, что и расстояние между некоторыми наиболее тесно сцепленными локусами на карте (около 0,02 единицы), возможно, что использованные Бензером методы действительно позволили учесть генетический эффект изменения в таком небольшом участке молекулы ДНК, как две пары нуклеотидов. Если предположение о том, что детали строения белка данного организма отражают химическую структуру его генетического материала верно, то на основании этих вычислений можно сделать вывод, что столь незначительное изменение структуры белка, как замена лишь одной аминокислоты, может оказаться мутацией, проявляющейся фенотипически. Читатель должен относиться ко всем этим рассуждениям весьма снисходительно. В настоящее время все эти гипотезы подвергаются интенсивной экспериментальной проверке, и мы должны надеяться, что изучение химии белка поможет заполнить разрыв между генетическими спекуляциями и химическими данными.

Прежде чем закончить обсуждение тонкой структуры генетического материала, необходимо кратко остановиться на другой методике нанесения на карту субъединиц генов. Эта методика, разработанная Циндером и Ледербергом в 1952 г., основана на явлении, называемом трансдукцией, при котором генетическая информация, содержащаяся в хромосоме бактерий, переносится от клетки к клетке фаговыми частицами. В некоторых бактериях обитают так называемые умеренные фаги, которые находятся в симбиотических отношениях с клеткой-хозяином и лишь редко вызывают ее лизис. Если же такой лизис происходит, то освобождающиеся при этом фаговые частицы инфицируют новые бактериальные клетки, и при этом они передают им некоторые генетические особенности исходной бактериальной клетки-хозяина. Обычно за один раз переносится только один фенотипический признак, как если бы фаг был способен переносить лишь один ген. Однако иногда переносится одновременно несколько генетических маркеров, что позволяет исследователю определить степень сцепления между двумя единицами наследственности или большим их числом.

Трансдукцию можно объяснить следующим образом: части «хромосом» фагов обмениваются с частями хромосом бактерий и после установления фагом симбиотических отношений в новой бактериальной клетке эта приобретенная информация передается фагом новому хозяину. Многие особенности трансдукции сильно напоминают трансформацию. В обоих случаях передача генетической информации, по-видимому, связана с физическим переносом ДНК, либо прикрепленной к фагу, либо свободной. Хотя оба эти явления обычно затрагивают только один генетический маркер, иногда они могут затронуть одновременно несколько маркеров. Многие авторы применяли трансдукцию для составления генетических карт бактерий нескольких видов; этот метод позволяет провести столь же тонкое различие между соседними генами как использованная Бензером методика скрещивания фагов. Однако, поскольку концепции «тонкоструктурной» генетики хорошо иллюстрируются исследованиями фагов, мы отсылаем читателя к имеющимся прекрасным обзорам, перечень которых приведен ниже, и перейдем к следующей теме — строению белка.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: