Факультет

Студентам

Посетителям

Основные методы получения ферментных препаратов из микроорганизмов

Ферментные препараты микроорганизмов могут быть получены из мицелия, бактериальной массы и культуральной жидкости. Многие ферменты переходят из мицелия в культуральную жидкость в результате автолиза клеток.

Работа по получению ферментов требует специальных предосторожностей, так как ферменты легко денатурируются и теряют активность. Поэтому рекомендуется проводить работу при низких температурах, избегать контактов с металлическими поверхностями и т. д.

В случае, если ферменты необходимо извлечь из мицелия, клетки должны быть предварительно разрушены. Разрушение клеток производится различными способами. Одним из самых старых лабораторных методов является растирание густой мицелиальной взвеси с кварцевым песком в ступке. Взвесь мицелия готовится, как правило, на физиологическом солевом растворе. При таком методе извлечения значительная часть белков и ферментов переходит в раствор.

Существуют также специальные гомогенизаторы. В них микробные клетки разрушаются под действием вращающихся с большой скоростью ножей особой формы. Некоторые микроорганизмы подвергаются разрушению за счет действия ультразвука.

Клеточные стенки некоторых микроорганизмов могут быть разрушены при воздействии на них фермента лизоцима. Лизоцим лизирует клеточные стенки, освобождая протоплазму оболочки.

Препаративное выделение ферментов во многом напоминает выделение белков. Обладающие близкими физико-химическими свойствами белки, в том числе ферментные белки, могут быть извлечены из мицелия водой, солевыми растворами или растворами щелочей низкой концентрации. Из таких экстрактов, разбавленных водой, автолизатов или из нативного раствора (культуральной жидкости, освобожденной от мицелия) может производиться фракционированное осаждение ферментов, используя высаливающее действие минеральных солей. К числу таких солей относятся сульфаты аммония, натрия и магния, хлористые соли калия и натрия, некоторые фосфаты и нитраты. Фракционирование проводится путем постепенного повышения концентрации высаливающих агентов в растворе. При этом можно выделить белковые вещества, выпадающие в осадок при различном насыщении раствора осадителем. Удаление высаливающих веществ производится диализом против водопроводной воды. Можно применять метод электродиализа. В этом случае раствор ферментного препарата с сульфатом аммония помещают в емкость, разделенную двумя полупроницаемыми мембранами на три части. В среднюю часть помещают раствор, содержащий ферментный препарат и высаливающее вещество, в боковых расположены электроды. Минеральные ионы перемещаются к соответствующим электродам, а фермент остается в средней камере.

Кроме высаливания минеральными солями, могут быть применены органические вещества — этанол, ацетон, диоксан, в разных концентрациях (50—75%). Пользуясь различными их концентрациями, можно также избирательно получать требуемую фракцию белка из раствора. Органическими растворителями можно экстрагировать ферменты из высушенного материала. Например, путем экстракции ацетоном из соевой муки Д. Самнером был впервые получен кристаллический фермент уреаза.

Полученные методами экстракции или высаливания ферментные препараты, как правило, содержат много посторонних примесей и поэтому степень их активности относительно невысока. Дальнейшую очистку ферментных препаратов проводят сорбционными методами, из которых в последние годы наибольшее значение имеет ионный обмен. О степени чистоты ферментного препарата обычно судят по нарастанию ферментативной активности при действии на специфический субстрат.

В качестве примера может быть приведен метод ионообменной очистки протеазы продуцента стрептомицина.

Из нативного раствора первоначально выделяется стрептомицин, затем раствор передается на ионообменную колонку, сорбирующую фермент. Фермент элюируется боратным буфером. Для получения кристаллического препарата после концентрирования раствора фермент сначала осаждается ацетоном, а затем выкристаллизовывается из ацетона. Все операции по извлечению и кристаллизации фермента проводятся при низких температурах.

Помимо ионитов, в качестве сорбентов могут применяться минеральные вещества: окись алюминия, окись магния, каолин и т. п. Сорбция происходит в определенных пределах pH, затем проводится элюция фермента из колонки буферным раствором.

Выделение ферментов может осуществляться также методом электрофореза на крахмальном или агаровом геле. После элюации из различных участков и определения ферментативной активности элюатов удается определить местоположение фермента в геле. Путем подбора соответствующих условий — буферные растворы, градиент потенциала, время, температура — можно добиться получения ферментных препаратов высокой степени чистоты. В настоящее время этот метод имеет значение лишь в лабораторной практике.

Высушивание полученных ферментных препаратов лучше всего проводить методом сушки сублимацией (лиофильной сушки), после предварительного замораживания раствора, содержащего фермент при минусовых температурах (—15, —40°).

Протеолитические ферменты. Грибы и актиномицеты способны использовать в качестве источников азотистого питания белковые соединения, содержащиеся в соевой муке, жмыхах, кукурузном экстракте и т. д. Превращение сложных белковых веществ в более простые азотсодержащие компоненты происходит с помощью протеолитических ферментов. Протеолитические ферменты подвергают гидролитическому расщеплению пептидную связь. Они действуют или на белки или на продукты их распада. Протеолитическая активность зависит от состава среды, на которой культивируется микроорганизм. При использовании в качестве источников азота аминокислот, пептидов и белков для культивирования продуцента стрептомицина Act. streptomycini было показано, что наивысшая протеолитическая активность среды отмечалась на средах с аминокислотами, низшая — на средах с белком. Аналогичные результаты были получены на средах с глицинином (белком соевой муки) и его кислотным гидролизатом.

При использовании в качестве источников азота минеральных азотсодержащих веществ величина активности зависит в основном от специфических особенностей культуры. Кроме того, активность протеолитических ферментов зависит также от значения pH среды, в которой действует фермент. Наибольшая протеолитическая активность наблюдается в пределах pH 7,2—8,2. При кислом значении pH активность резко падает (примерно в 2—3 раза). Активность фермента зависит и от субстрата. Различные белки при прочих равных условиях одним и тем же ферментом гидролизуются с различной степенью глубины гидролиза.

На активность фермента существенное влияние оказывают минеральные ионы, в частности ион Са++, который стабилизирует активность и может предотвращать денатурацию. При культивировании актиномицетов повышению активности способствует наличие в среде иона калия и присутствие глюкозы.

Накопление протеолитических ферментов в среде при биосинтезе стрептомицина происходит параллельно с образованием антибиотика. Однако это не является закономерным. Максимум протеолитической активности культуральной жидкости при биосинтезе альбомицина наступает позже максимума концентрации антибиотика, а при биосинтезе окситетрациклина — раньше.

Применительно к производству стрептомицина сближение кривых протеолитической и антибиотической активности имеет большое значение на практике. В Японии М. Номото и И. Нарахаси (1959, 1960) путем ионного обмена выделили протеазу из отходов производства стрептомицина. По этому методу из культуральной жидкости сначала получают стрептомицин, а затем протеолитические ферменты. Этот препарат, как и все другие изученные протеолитические ферменты актиномицетов, относится к трипсиноподобным ферментам. Препарат имеет относительную специфичность, он способен гидролизовать почти все пептидные связи, причем гидролиз идет до свободных аминокислот. В отличие от протеаз, выделенных из других объектов, препарат продуцента стрептомицина обладает весьма высокой активностью. Фирменное название препарата — проназа. Он не является индивидуальным веществом, содержит две пептидазы и четыре протеазы, отличающиеся по своим физико-химическим свойствам и специфичности.

При изучении протеолитических ферментов продуцента пенициллина Penicillium chrysogenum Q-176 было показано, что расщепление желатина совершается в две фазы. В первой фазе наблюдается падение вязкости растворов. Эта фаза может быть охарактеризована как дезагрегация; во второй фазе — гидролиз. По всей вероятности, гриб обладает комплексом протеаз, причем в первые часы развития культуры действуют ферменты с оптимумом при кислом значении pH (pH 6,6), затем вступают ферменты с оптимумом в нейтральных зонах pH и, наконец, с оптимумом при pH 7,8— 8,3 (Н. Л. Матиссон, 1958). Оптимум протеолитической активности культуры зависит в значительной степени от субстрата. В остальном протеолитические ферменты пеницилла мало чем отличаются от протеолитических ферментов актиномицетов.

При промышленном производстве протеиназ из микроорганизмов за рубежом, помимо названной культуры актиномицета, используют Asp. oryzae, Вас. subtilis. Ферментация осуществляется в таких же аппаратах, что в производстве антибиотиков. После удаления бактериальной массы или мицелия остается нативный раствор, содержащий, в частности, протеиназы. Промышленные препараты протеиназ в большинстве своем представляют собой смеси протеолитических ферментов.

Глюкозооксидаза. Глюкозооксидаза является одним из распространенных ферментов у грибов; описана она также и у некоторых актиномицетов. Фермент катализирует реакцию окисления глюкозы в глюконовую кислоту, а молекулярный кислород при этом восстанавливается до перекиси водорода.

Перекись водорода, в свою очередь, разлагается каталазой. Глюкозоксидаза имеет чрезвычайно большое значение в лабораторной практике. Благодаря ее высокой специфичности удается количественно определить глюкозу в смеси углеводов. Он может иметь применение при анализах в антибиотической промышленности, например при получении пенициллина, где в питательной среде присутствуют два углевода: глюкоза и лактоза.

Глюкозооксидаза представляет собой флавопротеид, имеющий простетическую группу в виде аллоксазин-адениндинуклеотида, условно названного флавинадениндинуклеотидом (ФАД). Согласно новой номенклатуре ферментов, принятой на V Международном конгрессе биохимиков, систематическое название фермента — β-D-глюкоза: O2-оксидоредуктаза. Глюкозооксидаза идентична с антибиотиками нотатином (из Pen. notatum) и микроцидом (из Pen. vitale). На основе производства микроцида из Pen. vitale на Украине разработаны методы получения глюкозооксидазы.

Сильное антибактериальное действие этих антибиотиков, возможно, обусловлено выделяющейся в присутствии глюкозы перекисью водорода. Однако в трактовке механизма действия антибиотика нет единого мнения. Например, Н. К. Монахов и С. А. Нейфах (1962) считают, что при наличии активной каталазы животных тканей и микроорганизмов не происходит накопления перекиси водорода. Они предполагают, что две различные функции фермента-антибиотика обусловлены различными активными центрами белковой молекулы.

Производство глюкозооксидазы зарубежными фирмами основано на применении Asp. niger. Внутриклеточные ферменты экстрагируются из мицелия и осаждаются прибавлением безводных органических растворителей. Промышленный препарат фермента содержит значительное количество каталазы. Помимо сухого препарата, выпускается бумага, пропитанная смесью ферментов глюкозооксидазы-пероксидазы и индикатора о-толидина. Если полоску такой бумаги смочить раствором, содержащим глюкозу, то в результате следующих реакций в течение одной минуты появляется синее окрашивание (окисленный о-толидин).

Амилолитические ферменты микроорганизмов. У микроорганизмов широкое распространение имеют амилазы, гидролизующие глюкозидные связи. Амилазы грибов отличаются от амилаз бактерий. Последние проявляют значительную активность при высоких температурах. Амилазы грибов при температурах 70—75° полностью теряют активность. Для хлебопечения применяют ферментный препарат из культуры Asp. niger. При ферментации α-амилаза накапливается в культуральной жидкости.

Для промышленного получения глюкозы из крахмала применяют последовательно бактериальные и грибные амилазы. Глубина гидролиза крахмала зависит, как известно, от активности α-амилазы (α-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза), β-амилазы (α-1,4-глюканмальтогидролаза) и α-глюкозидазы (α-D-глюкозидглюкогидролаза). Необходимо иметь такую культуру, которая гидролизует растворимый крахмал до глюкозы, т. е. обладает соответствующим ферментным комплексом. Такой культурой являются грибы рода Rhizopus. Они в одинаковой степени гидролизуют глюкозидные связи амилозы и амилопектина.

В отличие от грибов рода Aspergillus, Rhizopus не имеют активной трансглюкозидазы, в результате действия которой образуются некоторые олигосахариды, имеющие горьковатый вкус. Rhizopus обычно культивируют поверхностным методом с использованием пшеничных отрубей в качестве среды. Из культуры получают экстракт, из которого добавлением сульфата аммония выделяют осадок, содержащий необходимый фермент. Осадок используется в качестве препарата. Пресс гидролиза происходит в два этапа. Сначала 30—40% раствор крахмала предварительно обрабатывают бактериальной амилазой при 85—94°, pH 5—6. После разрушения бактериальной амилазы нагреванием при высокой температуре к полученному раствору добавляют ферментный препарат из Rhizopus и приводят гидролиз в течение нескольких часов при 55° и pH 4,5. Затем гидролизат подвергают дальнейшей обработке с целью получения кристаллической глюкозы.

Кроме Rhizopus, применяют некоторые культуры рода Endomycopsis. При ее глубинном культивировании амилолитические ферменты содержатся в культуральной жидкости. Для гидролиза крахмала в данном случае используется нативный раствор.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: