Пока Линфорд и его коллеги заканчивали свои опыты с галловой нематодой, повреждающей ананасы, во Франции было начато исследование других проблем, связанных с использованием хищных грибов в борьбе с нематодами.
Первые результаты этой работы появились в 1939 г., после чего исследования продолжались еще в течение 5 лет. Ведущая роль в этих исследованиях принадлежала профессору Е. Рубо (Институт Пастера в Париже) и работавшим вместе с ним Ж. Деказо, Р. Дешьену, Л. Лами и Э. Вотрену.
Французские исследования проводились главным образом в лабораторных условиях и в меньшей степени в полевых, хотя и были проведены два опыта по борьбе с нематодами — один с корневой галловой нематодой на бегонии, другой — с нематодой, паразитирующей у овец. Нематоды, поражающие животных, относятся к совершенно иной ветви рода Nematoda, чем свободноживущие и паразитирующие на растениях формы, но между этими группами существует родственная связь, и обе они подвергаются нападению хищных грибов.
Французские исследователи были особенно заинтересованы в использовании хищных грибов с ветеринарной точки зрения для борьбы с некоторыми более мелкими паразитическими нематодами у овец, крупного рогатого скота и лошадей. Такие паразиты могут вызвать серьезные потери среди сельскохозяйственных животных; заражение ими происходит при выпасе животных на зараженных пастбищах. К началу указанной работы никаких данных о существовании хищных грибов, истребляющих нематод — паразитов животных, еще не было известно, поэтому французам прежде всего предстояло доказать, что такие явления вообще возможны.
Французские ученые использовали в своих опытах только три вида грибов: Arthrobotrys oligospora (клейкие сети), Dactylella ellipsospora (клейкие выросты) и D. bembicodes (сжимающиеся кольца). Грибы выращивались в чистой культуре на питательном агаре, а затем изобретались различные способы введения нематод в эти культуры. Один остроумный метод основан на приготовлении навозных культур нематод; для этой цели экскременты зараженных лошадей смешивали с древесным углем и увлажняли водой. Грибы Arthrobotrys oligospora и Dactylella bembicodes были выращены в чашках с навозным агаром, т. е. на питательном агаре, приготовленном на настое экскрементов. Когда грибы разрастались настолько, что закрывали всю поверхность агара, крышку с чашки снимали, а нижнюю часть чашки, содержащую грибы, перевертывали кверху дном над другой чашкой, в которой помещалось некоторое количество культуры нематод. Затем полоски фильтровальной бумаги располагали вертикально таким образом, чтобы их нижние концы соприкасались с культурой нематод, а верхние — с агаром, содержащим грибы. Личинки нематод из культуры на навозе использовали фильтровальную бумагу в качестве лестниц и взбирались по ней на агар, где их поджидали грибы.
Переселение нематод по бумажным лестницам достигало наивысшей интенсивности на 4-й день после установки такого аппарата. Грибы начинали реагировать на появление своих жертв примерно через 24 часа, образуя ловушки и захватывая личинок по мере их появления на агаре; через 3 недели все личинки из навозных культур мигрировали вверх по фильтровальной бумаге и были, конечно, выловлены и уничтожены грибами. При испытании описанным методом Arthrobotrys oligospora и Dactylella bembicodes оказались одинаково эффективными.
В некоторых последующих опытах эти же два вида грибов испытывались против нематод, паразитирующих в овцах и крупном рогатом скоте. В данном случае был применен другой метод. Грибы выращивались в жидких культурах, питательная среда представляла собой просто настой экскрементов без добавления агара. При введении личинок нематод в жидкие культуры грибы совершенно свободно уничтожали их, несмотря на непривычные окружающие условия, а поскольку грибы оказались высокоэффективными и в жидкой среде, возникло предположение о возможности использования их для «обеззараживания» воды, содержащей нематоды. Если подобный метод окажется осуществимым, это будет крупным шагом вперед, так как заражение животных часто происходит именно через питьевую воду.
Но не только нематоды, паразитирующие в лошадях и крупном рогатом скоте, послужили объектом французских экспериментальных исследований; в начале работы было проведено несколько опытов на личинках Ancylostoma duodenale, кишечного паразита человека, и Strongyloides fulleborni, нематоды из кишечника шимпанзе. В этих опытах применяли другую методику. Культуры Dactylella ellipsospora (клейкие выросты) выращивали обычным путем на питательном агаре в чашках Петри, подмешивая к нему немного овсяной муки и солодового экстракта для питания грибов. Затем в культурах вырезали небольшие, размером примерно 2,2 кв. см, кусочки агара и оставшееся после них пространство заполняли водой, образуя таким образом «влажные камеры», которые французы назвали «logettes humides». Через 5—6 дней гриб разрастался на поверхности агара в чашках и гифы его достигали «влажных камер».
Нематод получали из навозных культур и помещали в описанные «влажные камеры»; было установлено, что через 3—4 дня на гифах, достигших камер, появлялись клейкие выросты, забиравшие в плен личинок нематод. Иногда нематодам удавалось сначала отрываться от клейких выростов, прилипавших к ним, но в конечном счете все они бывали выловлены и уничтожены.
Метод устройства «влажных камер» в агаре, на котором выращивались культуры, применялся с целью обеспечения влажности, достаточной для существования нематод, которые в противном случае не могли бы выживать в течение требуемого времени и служить достойной добычей для грибов.
Опыты с «влажными камерами» были повторены с использованием Arthrobotrys oligospora (клейкие сети) и Dactylella bembicodes (сжимающиеся кольца) в качестве испытуемых объектов и дали такие же положительные результаты. Вполне удовлетворительные результаты были получены и при испытании обоих этих грибов против Oesophagostomum bifurcatum, другого паразита обезьян, и против стронгилоидной нематоды, поражающей крупный рогатый скот.
В работе с нематодами, паразитирующими на животных, интересно отметить относительно крупные размеры некоторых из них, которых грибы тем не менее успешно уничтожали. Так, например, при работе с паразитами лошадей оказалось, что Dactylella bembicodes, Arthrobotrys oligospora и в несколько меньшей степени Dactylella ellipsospora успешно справляются с личинками Strongylus и Cylicostoma, достигающими длины до 1 мм. Если вспомнить, что диаметр гиф, несущих клейкие сети Arthrobotrys oligospora, не превышает 5 μ, то легко себе представить, что здесь имеет место своего рода подвиг, тем более что попавшая в плен нематода вовсе не является пассивной жертвой: она борется за свою свободу так же, как лосось, попавшийся на крючок.
Французские исследователи занимались не только ветеринарными проблемами; они провели некоторые интересные опыты и с нематодами, образующими корневые галлы на бегонии. Личинок этой нематоды можно легко добыть, вскрывая галлы, образуемые на корнях растений бегонии. Личинки помещали в чашки Петри в воду, в которую добавляли небольшие кусочки агаровой культуры Dactylella bembicodes. За 10 дней гриб уничтожил при помощи своих сжимающихся колец 90% всех нематод. Опыт был повторен с Arthrobotrys oligospora и Dactylella ellipsospora и дал такие же хорошие результаты, хотя эти два гриба действовали несколько медленнее.
После выявления способности указанных 3 видов грибов расправляться с корневыми галловыми нематодами были поставлены опыты для выяснения эффективности их деятельности в почве. Данные опыты представляли особенно большой интерес, так как являлись первой попыткой проведения непосредственных наблюдений над поведением хищных грибов в почве. Значение их не требует пояснений.
Квадратики агара, вырезанные из культуры Dactylella bembicodes, закапывали на глубину 5 см в почву, сильно зараженную корневой галловой нематодой; предварительно их помещали в шелковую сетку, соединенную с шелковой нитью, привязанной к колышку на поверхности почвы: таким образом, квадратики агара легко можно было извлечь из почвы через требуемый промежуток времени. Через 15 дней эти сетки осторожно вынимали из почвы и исследовали квадратики агара под микроскопом. Грибы образовали много сжимающих колец, в которые попалось большое число нематод. При подсчете жертв оказалось, что на 6,5 кв. см поверхности агара приходилось около 30 пойманных нематод.
Наблюдения были продолжены для того, чтобы выяснить, если возможно, насколько хищные грибы могут далеко распространиться в почве из какой-либо определенной точки; эти данные будут иметь весьма важное значение в случае практического применения инокуляции почвы хищными грибами, так как радиус действия гриба будет определять потребные количества инокулума на единицу площади. Очень мелкие, длиной 2,5 мм, куски соломин, несущие споры Dactylella bembicodes, были смешаны с почвой, зараженной корневой галловой нематодой, и оставлены в ней на 15 дней; за это время споры гриба проросли и тонкие гифы начали распространяться в стороны от мицелия, вытягиваясь во всех направлениях, как нити паутины. Через 15 дней почву, окружающую «островки» соломы, тщательно исследовали и обнаружили, что гифы гриба хорошо развились на протяжении 1,87 см от «островка» соломы.
На основании этих данных можно вычислить, сколько понадобится соломы, зараженной спорами, для такой инокуляции почвы, при которой грибы образуют сплошную паутину мицелия, преграждающую нематодам путь всюду, где бы они ни находились. Если придавать этому опыту какую-либо легальность, то следует добиваться, чтобы кусочки соломы после тщательного смешивания с верхним слоем почвы на участке располагались в среднем не дальше, чем на расстоянии 2,5 см друг от друга, так, чтобы нити мицелия, отходящие от каждого куска соломины, смыкались бы с соседними. Опыты показали, что такое расположение можно обеспечить путем смешивания 100 г соломы с 60 кг почвы. В практических условиях потребуется вносить около 5 т соломы на 1 га.
Но аргументацию необходимости внесения числа тонн соломы на гектар на основании данных, полученных при смешивании какого-то количества граммов соломы с килограммами почвы, следует считать недостаточно обоснованной при такой работе, где приходится учитывать много переменных факторов; поэтому приведенные выше цифры не следует пока принимать всерьез, даже если бы практически удалось обеспечить в полевых условиях требуемое равномерное перемешивание поверхностного слоя почвы. Кроме того, и самый опыт не лишен недостатков. По данным экспериментатора, гриб переставал распространяться в почве, как только отдалялся на определенное расстояние от исходной точки, в данном случае от куска соломины. Но следует помнить, что в условиях опыта гриб имел возможность расти только в течение 15 дней; между тем многие хищные грибы с сжимающимися кольцами типа Dactylella bembicodes растут медленно, и поэтому трудно рассчитывать, что за такой короткий срок, как 15 дней, они могут достигнуть максимального роста. Быстрорастущие грибы, например Arthrobotrys oligospora, могут, вероятно, дать совершенно иные результаты.
Другая проблема, которую изучали французские исследователи, касалась влияния хищных грибов на растительность и домашних животных, потому что как бы эффективно они ни уничтожали нематод, но если бы при этом они повреждали и культуры, которые должны защищать, то польза их была бы сведена к нулю. Для выяснения этого вопроса на пастбище было выделено два одинаковых огороженных участка площадью 8,4 кв. м. Один из них искусственно заразили спорами Arthrobotrys oligospora, Dactylella ellipsospora и D. bembicodes из расчета примерно 4000 спор на 0,8 кв. м. Затем на каждый участок было выпущено по 2 овцы. Исследование проб почвы показало, что все 3 вида гриба прочно обосновались на опытном участке. У овец никаких болезненных явлений не наблюдалось, а проведенное в конце года обследование растительности обоих участков показало, что между ними никакой разницы нет. По-видимому, грибы не наносили вреда ни растениям, ни животным.
В другом опыте в корм одной пары кроликов в течение 2 месяцев добавляли культуры хищных грибов. До самого конца этого периода у животных никаких болезненных явлений не отмечалось и при сравнении их с другой парой кроликов, не получавших грибов в корме, никакой разницы обнаружено не было.
Примерно за 2 года до этих опытов производили скармливание хищных грибов домашним животным по совершенно иным соображениям. Так как некоторые паразитические нематоды обитают в кишечнике животных, то считалось, что наилучшим способом борьбы с ними является включение хищных грибов в корм животных; кроме того что грибы непосредственно соприкасались в этом случае с нематодами в наиболее удобном для них месте, предполагалось также, что выходящие с экскрементами споры или мицелий гриба будут способствовать очищению зараженных пастбищ от нематод. Культуры Arthrobotrys oligospora и Dactylella bembicodes, приготовленные на отрубях, в течение 2 дней скармливались в больших количествах 2 лошадям и 2 морским свинкам. Почему были выбраны морские свинки для этой цели, я не знаю, может быть по той вполне понятной причине, что гибель морской свинки обходится дешевле, чем гибель лошади.
Этот опыт, к сожалению, не дал желаемых результатов. Животные, правда, не пострадали, но грибы не выживали, так как при регулярном исследовании экскрементов животных в течение 9 дней не удалось обнаружить даже следов их. По-видимому, хищные грибы погибали при прохождении через кишечник животных, вероятно под воздействием пищеварительных соков. Об этом можно только пожалеть, потому что идея была очень заманчива.
Часть усилий французских исследователей была направлена на производство культур хищных грибов в больших масштабах, причем для этой цели были разработаны некоторые остроумные методы, преимущественно в области получения больших количеств спор хищных грибов. Вначале это казалось очень трудной задачей. Обычный питательный агар хотя и обеспечивал интенсивное развитие мицелия гриба, но не мог способствовать достаточно обильному спороношению его. Это затруднение в конце концов было преодолено путем добавления к агару измельченной соломы, которая, по-видимому, стимулировала спорообразование у грибов; при этом споры в основном образовывались на соломе, и такую солому, сплошь покрытую спорами, можно было затем выбирать из колб с культурами грибов и использовать для инокуляции почвы.
При другом способе, без использования соломы, грибы выращивались в больших сосудах на агаровой питательной среде до момента максимального спорообразования. Для извлечения спор в колбы насыпали соответствующее количество сухого инертного порошка, например стерилизованной и распыленной почвы, осторожно встряхивали их и затем высыпали споры вместе с порошком; полученную смесь подсушивали и хранили до тех пор, пока в ней не появлялась необходимость. Установлено, что высушенные споры сохраняли жизнеспособность в течение года.
Были проведены также опыты массового производства гриба на жидких питательных средах. В качестве среды в этих опытах использовали отвар, приготовленный путем кипячения зерен кукурузы в воде; полученную жидкость фильтровали и добавляли к ней солодовый экстракт. Готовый отвар разливали в пробирки и стерилизовали; затем пробирки инокулировали культурой того гриба, который нужно было вырастить, и оставляли культуры развиваться. Примерно через 2 недели на поверхности жидкости в пробирке появлялся диск мицелия и гриб начинал образовывать споры; спорообразование достигало максимума примерно через 30 дней после инокуляции пробирок. В это время диски мицелия вместе со спорами извлекали из пробирок, высушивали и смешивали с высушенным листовым перегноем. Подсчеты показали, что каждый диск мицелия содержал в среднем 117 420 спор, так что при разбавлении соответствующим наполнителем сравнительно небольшое число таких дисков может хватить на долгое время.
Теперь мы переходим к наиболее волнующей части французских работ — испытанию хищных грибов в борьбе с нематодами в полевых условиях. Были проведены два таких опыта, один с нематодами, паразитирующими в животных, другой — с корневой галловой нематодой, поражающей растения бегонии.
Первый опыт был поставлен на двух видах нематод, паразитирующих в овцах, — Strongyloides papillosum и на одном из видов Bunostomum. На пастбище, зараженном Strongyloides, отгородили два одинаковых загона и в обоих на поверхности почвы разбросали яйца Bunostomum. Затем произвели заражение одного из загонов спорами 3 видов хищных грибов — Arthrobotrys oligospora, Dactylella ellipsospora и D. bembicodes. После этого в каждый загон выпустили по паре здоровых 10-месячных овец и предоставили им пастись.
Через 35 дней обе пары овец были перевезены в Институт Пастера, где их поместили раздельно и держали под постоянным наблюдением. Образцы их экскрементов исследовали через 34 дня после удаления с пастбища и вторично — через 78 дней. В экскрементах животных из контрольного, не зараженного грибами загона, были обнаружены многочисленные яйца и личинки Strongyloides papillosum и некоторое количество яиц Bunostomum; в экскрементах животных из загона, обработанного грибами, яиц Strongyloides совершенно не оказалось и было обнаружено лишь небольшое число яиц Bunostomum. В то же время у животных из контрольного загона были отмечены явные симптомы заражения нематодами, тогда как у животных из загона, обработанного грибами, такие симптомы отсутствовали; проведенное вскрытие в основном подтвердило указанные наблюдения, хотя при исследовании туш после забоя оказалось, что животные из загонов, зараженных грибами, были слегка поражены Bunostomum.
Эти данные выглядят довольно убедительно, но мы должны стремиться избегать ложных выводов, вполне возможных в случае переоценки недостаточно доказательных данных. Давайте посмотрим, что может получиться при статистической обработке материала подобных опытов. Предположим, что 2 овцы из 4 в силу свойственной им идиосинкразии, о которой экспериментатор не мог даже подозревать, оказались более восприимчивыми к заражению нематодами, чем две другие. Если, по несчастью, эти 2 восприимчивые овцы были использованы в качестве контрольных животных, тогда как их более стойкие товарки отправились в загоны, зараженные грибами, то результат, сходный с фактическим, мог получиться без всякого участия грибов; в этом случае мы были бы совершенно неправы, предположив, что грибы оказали какое-то влияние на результаты опыта.
Насколько велика вероятность такого случая? Обозначим наших 4 животных буквами А, В, С и D. Мы должны выбрать из них двух для контрольного загона, а двух других оставить для опыта. Сколько различных комбинаций может возникнуть при выборе 2 овец из общего числа их, т. е. из четырех? Здесь возможны следующие сочетания: АВ, AC, AD, ВС, BD и CD. Таким образом, существует один шанс из шести, что для контрольного загона случайно окажутся отобранными именно 2 восприимчивые овцы; иными словами, за это имеется один шанс против пяти. Между тем любой букмекер скажет нам, что при одном шансе против пяти лошадь имеет далеко не малую возможность одержать победу в конных состязаниях, и, действительно, многие лошади, выигравшие призы Дерби, стартовали при меньших шансах на успех. Если против возможности сделать неправильные выводы в опытах с овцами имеется всего пять шансов, было бы просто глупо делать какие-либо выводы на основании подобного материала. Другими словами, опыт ничего не доказывает.
Очень жаль, что описанный опыт не был проведен на более обширном материале. Если в каждом загоне содержалось бы 10 овец, то, вероятно, можно было бы получить вполне определенные результаты; работая с двумя парами овец, просто невозможно обеспечить даже приблизительную достоверность. Однако все сказанное еще не означает, что данный опыт нужно просто зачеркнуть. Хотя он и недостаточен для окончательных выводов, но тем не менее дает основание предполагать, что грибы могут оказать какую-то защиту против нематод; наиболее естественным ходом событий была бы постановка вслед за ним более широких опытов, но этого, к сожалению, не было сделано. Лучше было бы использовать для этой цели 50 морских свинок, чем 4 овец.
Второй опыт по борьбе с нематодами был проведен в Париже. Объектом его служила корневая галловая нематода, поражающая бегонии, а из хищных грибов были испытаны Arthrobotrys oligospora и Dactylella bembicodes. Работа проводилась в теплице, где черенки бегонии выращивали в горшках с вересковым компостом, установленных в слое торфа. Почва в горшках была заражена галловой нематодой; источником инфекции, очевидно, был торф.
В этом опыте споры грибов были внесены в 21 горшок, а 18 горшков, в которые споры не добавлялись, служили контролем. Из 21 горшка, почва которых была заражена грибами, в 10 был внесен Arthrobotrys oligospora и в 11 — Dactylella bembicodes. Во все горшки были высажены черенки бегонии; рост растений продолжался с марта до конца сентября; в конце этого периода все они были исследованы на зараженность корневой галловой нематодой, причем степень зараженности определялась по числу растений, имеющих галлы на корнях, и по фактическому количеству галлов на корнях подопытных и контрольных растений. Оказалось, что из 21 растения бегонии, находившихся под защитой грибов, было заражено 3, причем всего на них было обнаружено 5 галлов, тогда как в горшках, не зараженных грибами, из 18 растений было заражено 8, а общее число обнаруженных на них галлов равнялось 85.
Из этих цифр видно, что в контрольных горшках, где не было грибов, 44% растений было поражено нематодами, а в горшках, заселенных грибами, — только 14%. Эти результаты, несомненно, производят определенное впечатление, но следует помнить, что проценты часто бывают очень обманчивы, особенно если они вычислены на основании небольших чисел. В данном случае во всем опыте было использовано только 39 растений. При таких условиях мы вправе подозревать, что различия в степени заражения растений в контрольной и опытной сериях носят случайный характер и не обусловлены деятельностью грибов.
Простое статистическое вычисление показывает, что вероятность того, что эта разница не обусловлена случайной изменчивостью и не имеет ничего общего с внесением в почву хищных грибов, составляет 10 к 1. Такое соотношение, конечно, более благоприятно, чем отношение пять к одному, вычисленное нами для опытов с овцами, но все еще далеко не достаточно. Чтобы быть уверенным в том, что различия между числом зараженных растений в обеих сериях опыта вполне достоверны, шансы против случайного распределения зараженных растений в подопытной и контрольной сериях должны составлять не менее девятнадцати против одного. В данном случае это требование не выполнено.
Более благополучно обстоит дело в отношении фактической численности галлов на корнях зараженных растений — 5 галлов на 21 растении в горшках, зараженных грибами, и 85 галлов на 18 контрольных растениях. Но, к сожалению, французы не указывают числа галлов, обнаруженных на отдельных растениях, а приводят лишь общие цифры по обеим сериям. Это обстоятельство не позволяет вычислить вероятность случайного распределения зараженности, так что мы не имеем возможности определить степень достоверности результатов.
Остается только пожалеть, что опыт па бегониях не был выполнен в более широком масштабе, так как при большем числе растений полученные результаты имели бы большую ценность. При существующем положении различия между опытной и контрольной группами недостаточно велики и статистически недостоверны, так что результаты опыта, хотя и представляют интерес, не могут расцениваться как безусловно достоверные. Поэтому наш приговор в данном случае должен гласить «не доказано».
Некоторые нематоды, например Bunostomum trigonocephalum, могут проникать очень глубоко в почву или под воду. Чем дальше вглубь от поверхности, тем меньше становится приток воздуха, так что любой организм, живущий глубоко под поверхностью — почвы или воды, — неизбежно будет испытывать недостаток кислорода для дыхания. Эти соображения заставили французских исследователей заинтересоваться вопросом о том, до какой глубины могут проникать в воду хищные грибы.
Для выяснения этого вопроса были использованы три обычных вида грибов — Arthrobotrys oligospora, Dactylella ellipsospora и D. bembicodes. Стеклянные пробирки были заполнены жидкой питательной средой до различного уровня, вплоть до высоты 20 см, и затем инокулированы грибами. Грибы Arlhrobolrys oligospora и Dactylella ellipsospora держались на поверхности среды; через 60 дней первый вид продвинулся вглубь меньше чем на 1,25 см, а второй — и того меньше; отсюда следует, что оба этих вида могут расти и развиваться лишь при обильном доступе воздуха. И наоборот, Dactylella bembicodes прекрасно развивался на глубине 20 см, хотя при полном прекращении доступа воздуха этот гриб тоже переставал расти.
При всех попытках использовать хищные грибы для борьбы с нематодами в воде необходимо выбирать для этой цели вид, способный выносить ограниченный доступ воздуха; тоже относится и к заболоченной почве. В нормальной пахотной почве такие затруднения не могут возникнуть, потому что в плодородной почве между почвенными частицами всегда имеются воздушные пространства, вполне достаточные для роста грибов. Мы не располагаем никакими данными относительно глубины, на которой хищные грибы держатся обычно в почве, а такие сведения были бы чрезвычайно полезны.
Оценивая работы французских исследователей в целом, можно сказать, что в них имеется много потенциально ценного. Совершенно новым подходом является исследование ветеринарной стороны вопроса; кроме того, удалось показать многостороннюю способность некоторых хищных грибов уничтожать самые различные виды нематод. К сожалению, часть работ выполнена на очень небольшом материале; проведение этих опытов в более широком масштабе, несомненно, дало бы весьма ценные результаты.
Описанные работы были закончены свыше 10 лет назад, и с тех пор, по-видимому, никаких исследований по данному вопросу во Франции не проводилось. Это не может не удивлять, если принять во внимание значение нематод как вредителей сельскохозяйственных культур и паразитов животных. Будем надеяться, что со временем эти исследования возобновятся.