Механизм противомикробного действия стрептомицинов весьма сложный.
Они подавляют процессы образования многих ферментов протеолитического действия, вследствие чего нарушается синтез белка. Они блокируют образование РНК и усиливают распад ее, а это ведет к выделению в окружающую среду аминокислот, ионов калия и нуклеотидов. Кроме того, стрептомицины нарушают проницаемость клеточной мембраны и тормозят аэробный распад углеводов частично вследствие нарушения протеолиза, а частично благодаря нарушениям в цикле карбоновых кислот.
Стрептомицины вступают в реакцию с сульфгидридными группами многих легко взаимодействующих соединений. Проникая в микробную клетку даже в незначительных количествах, они вступают в реакцию, прежде всего, с ферментами, содержащими эти группы. В результате этого резко ослабевает участие пировиноградной и щавелевоуксусной кислот в углеводном обмене, нарушается аэробный тип дыхания и др.