Для того чтобы создать рекомбинантную способную к репликации молекулу ДНК, необходимы клонирующие векторы и целый арсенал специальных ферментов — обязательных инструментов всех этапов этого процесса. Прежде всего это эндонуклеазы рестрикции и лигазы.
Эндонуклеазы рестрикции. Молекулярное клонирование стало возможным только после выделения высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двуспиральной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи. Эти ферменты называются эндонуклеазами рестрикции (рестрицирующими эндонуклеазами, рестриктазами) типа II.
Ферменты рестрикции узнают участок ДНК, содержащий специфическую палиндромную последовательность (последовательность-перевертыш, идентичную в обеих цепях при прочтении их в направлении 5′ → 3′) из нескольких пар нуклеотидов и вносят разрыв в каждой цепи, расщепляя фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами. Одни эндонуклеазы гидролизуют цепи ДНК так, что в результате образуются односпиральные концы, содержащие комплементарные нуклеотиды — липкие концы, другие же ферменты расщепляют с образованием тупых концов.
Одна из первых эндонуклеаз рестрикции типа II была выделена из бактерии Escherichia coli и получила название EcoRI. Этот фермент узнает специфическую палиндромную последовательность из шести пар оснований и вносит разрыв между остатками аденина и гуанина в каждой цепи. В результате образуются односпиральные концы, содержащие по четыре комплементарных нуклеотида (липкие концы).
Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа II и в которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Сайты узнавания ферментов могут содержать четыре, пять, шесть, восемь и более пар нуклеотидов. От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК; в большинстве случаев используют эндонуклеазы рестрикции, узнающие тетра — и гексануклеотиды.
Рестрицирующие эндонуклеазы типа II играют ключевую роль при клонировании фрагментов ДНК. Когда два разных образца ДНК обрабатывают одним и тем же ферментом с образованием фрагментов с липкими концами, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплементарному спариванию липких концов фрагментов разных образцов могут образовываться новые комбинации генов — рекомбинантные ДНК, а также исходные молекулы.
Лигаза. Для осуществления молекулярного клонирования недостаточно только ферментов рестрикции. Водородные связи между теми основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны. Чтобы удержать два объединившихся фрагмента, т. е. для восстановления связи между 3′-гидроксильной группой одной цепи и 5′-фосфатной группой другой цепи, необходим фермент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы. Таким ферментом являются ДНК-лигазы, например ДНК-лигаза бактериофага Т4. Этот энзим катализирует образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. В результате двухцепочечная структура молекулы ДНК восстанавливается. Также ДНК-лигаза Т4 может образовывать фосфодиэфирные связи между тупыми концами, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты ДНК связываются с ферментом.
Именно с помощью этих ферментов (эндонуклеаз и лигаз) осуществляют встраивание фрагмента ДНК в плазмидный вектор.
Плазмидные векторы. Плазмиды — это внехромосомные автономно реплицирующиеся двуспиральные кольцевые молекулы ДНК у бактерий. Каждая плазмида содержит сайт начала репликации (origin of replication, ori), без которого ее репликация в клетке была бы невозможна. Размер плазмид варьирует от 1 до 500 тыс. п. н.
Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемого фрагмента ДНК (вставки). Однако высокоэффективный вектор должен обладать рядом обязательных свойств. К таким важным свойствам относятся:
а) небольшой размер, так как эффективность переноса ДНК снижается при величине плазмиды более 15 тыс. п. н.;
б) наличие уникального сайта эндонуклеазы рестрикции, по которому может быть осуществлена вставка;
в) наличие одного или более селективных генетических маркеров для распознавания клеток-реципиентов, которые содержат вставку. Поэтому плазмидные векторы приходится создавать с помощью генной инженерии.
Одним из первых и очень популярных в 1980-е годы был универсальный вектор pBR322.
Длина плазмиды pRR322 — 4361 и. н. Она несет два гена устойчивости к антибиотикам — ампициллину (ampR) и тетрациклину (tetR), а также уникальные сайты для ферментов BamHI, и SaII в гене tetR, один сайт PstI в гене ampR, сайты для EcoRI и PvuII за пределами кодирующих последовательностей и сигнал начала репликации (ori), обеспечивающий репликацию исключительно в Е. coli. Плазмида реплицируется с образованием большого числа копий, в другие бактериальные клетки переносится с трудом.
Помимо плазмиды pBR322 существует множество других векторов для клонирования. Все они отвечают двум основным требованиям: наличие нескольких сайтов для клонирования (сайты узнавания для нескольких эндонуклеаз рестрикции) и возможность достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК (чаше всего гены устойчивости к антибиотикам).
Как на основе плазмидного вектора можно создавать рекомбинантные молекулы ДНК?
Плазмидный вектор обрабатывают ферментом рестрикции (например, EcoRI), расщепляющим ее в единственном сайте, расположенном в одном из генов устойчивости к антибиотику (letR), и образуется линейная молекула с липкими концами. Такие линейные молекулы смешивают с донорной ДНК, предварительно обработанной этой же эндонуклеазой EcoRI. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТФ, в результате чего образуются рекомбинантные молекулы ДНК, содержащие вставку внутри одного из селективных генов (tetR). Далее необходимо ввести полученную конструкцию в клетку-хозяина.