Чтобы установить присутствие нематод в растениях, можно их изолировать или окрасить прямо в ткани хозяина.
В последнем случае необходим определенный навык в диагностике, иначе точно определить нематод, из-за интенсивного окрашивания выделяющихся на фоне ткани, не удастся.
Большинство приведенных в этом разделе методов основано на способности подвижных стадий нематод активно покидать заселенные ткани растений.
Мацерация растительной ткани. Мацерация растительной ткани при незначительных затратах на исследования обеспечивает первую информацию о некоторых родах нематод, для количественных показателей этот метод мало или совсем непригоден. Его преимущество заключается в непосредственном и быстром выявлении нематод и яиц представителей родов Aphelenchoides, Anguina, Ditylertchus, Meloidogyne и Tylenchulus.
Небольшое количество свежего растительного материала (корневые галлы, части побегов, листья) помещают в часовое стекло с несколькими миллилитрами воды и осторожно разрушают с помощью двух игл. Нематоды, обычно обитающие в тканях растения в огромном количестве, таким путем высвобождаются, а частично сами активно выходят в воду, и их можно точно определить под лупой или стереомикроскопом.
Чашки Остенбринка. В этом методе, разработанном Остенбринком на основе данных Баэрманна, используется, с одной стороны, большая подвижность многих нематод и с другой — их неспособность плавать. В чашку с плоским дном подвешивают сетку, выложенную фильтром из ваты. На фильтр наносят максимально тонким (5 мм) равномерным слоем измельченный на частицы размером 5—10 мм растительный материал (корни, части побегов, листья, почки). Затем чашку заполняют водой так, чтобы она укрывала фильтр полностью, а растительный материал — частично. Потери воды от испарения нужно регулярно возмещать, а воду в чашке менять через каждые три дня.
Нематоды, активно покидающие пораженную ткань, проходят через ватный фильтр и сетку и собираются на дне чашки. Воду из чашки (суспензия нематод) после многократного встряхивания сливают в химический стакан или мерный цилиндр. Приблизительно через 20 мин нематоды опускаются на дно сосуда; покрывающий их слой воды осторожно сливают, а остаток вместе с нематодами переносят на счетное стекло. Общий период исследования продолжается несколько дней — от 5 (листья) до 20 (корни).
Преимуществам этого метода (незначительное количество исследуемого материала, тщательное отделение нематод) противостоят существенные недостатки — слишком длинный период выявления и ошибка опыта в пределах 20—40%, поэтому его используют только для количественных анализов. Данный метод позволяет выявлять виды Aphelenchoides, Ditylenchus, Pratylenchas, а также активные стадии Meloidogyne spp., Heterodera spp. и Globodera spp. Для определения неактивных стадий и малоподвижных видов нематод он непригоден.
Вороночный метод Деккера. Модифицированный Деккером вороночный метод Баэрманна не требует сложного оборудования. Закрепленная в штативе воронка диаметром 10—15 мм с конусом примерно 50° имеет на выходе резиновый шланг, закрытый зажимом. Исследуемый мелконарезанный материал равномерным слоем толщиной 5 мм раскладывают на сетке с ватным фильтром. Поместив сетку в воронку, заливают воду так, чтобы исследуемый материал был покрыт полностью. За период от 3 до 20 дней активные нематоды проходят через ватный фильтр и сетку и собираются в трубке воронки, откуда их осторожно выпускают с частью воды, открыв зажим.
Подсчет и при необходимости определение нематод проводят в чашках Петри (диаметр 5 см) или на специально размеченных счетных стеклах. При продолжительном выходе нематод (корни) через каждые три дня необходимо менять воду. Добавление слабого раствора перекиси водорода (0,3%) позволяет несколько ускорить выход нематод.
Метод Деккера имеет как преимущества — незначительное количество материала, легко собираемый прибор, тщательное отделение нематод от субстрата, короткий промежуток, времени для замены проб, так и существенные недостатки: 1) метод пригоден только для выявления подвижных стадий нематод; 2) покоящиеся стадии, малоподвижные виды и нематоды с длиной тела более 1,5 мм с его помощью обнаружить нельзя; 3) исследования проб корней дают результаты через 14—20 дней; 4) при ошибке опыта в пределах 10—30% метод лишь ограниченно пригоден для точного количественного анализа; 5) объем исследуемых проб в зависимости от размера сетки относительно мал.
Метод Деккера используют для исследований растительного материала (листья, почки, части побегов, корни) на зараженность нематодами родов Aphelenchoides, Ditylenchus, Pratylenchus, а также подвижными стадиями Meloidogyne spp.
Метод Штемердинга. Предложенный Штемердингом метод в основных чертах схож с методами Деккера и Остенбринка. Чтобы ускорить выход нематод, промытый и крупно нарезанный растительный материал измельчают несколько секунд в миксере с крестообразным ножом при 10 000 об/мин. Полученную суспензию осторожно пропускают через ватный фильтр, осадок переносят в воронку (вороночный метод) или в чашку Остенбринка. Выход активных нематод заканчивается через 2—3 дня, но слишком длительная обработка материала в миксере ведет к повреждениям, а затем к гибели подвижных нематод.
Данный метод применяют для выявления активных стадии эндопаразитических и полуэндопаразитических нематод (Aphelenchoides, Ditylenchus, Meloidogyne, Pratylenchus).
Метод опрыскивания. Выход нематод из тканей можно ускорить путем достаточного увлажнения при одновременной обильной обеспеченности кислородом, например опрыскиванием растительного материала. Чисто отмытый и измельченный до 5 мм материал (корни, листья, части побегов) раскладывают плоским слоем на сетке, вставленной в воронку, и постоянно увлажняют с помощью закрепленного над сеткой распылителя.
По методу Зейнхорста, короткую воронку закрепляют в штативе так, чтобы ее конец находился в центре широкой плоской чашки. Нематоды, покидающие растительный материал, вместе с капающей или стекающей через край воронки водой попадают в чашку и остаются на ее дне, так как вода и поступает в чашку, и переливается через ее края с одинаковой незначительной скоростью.
Более высокую объемную концентрацию нематод обеспечивает метод Остенбринка, представляющий собой комбинацию опрыскивания и вороночного метода Баэрманна в модификации Деккера. В этом случае избыток воды (100—500 мл/ч) стекает через край воронки.
Метод двойной воронки, разработанный Хомейером, гарантированно обеспечивает всплывание нематод. В наружную воронку, на трубку которой натянут резиновый шланг, вставлена вторая воронка без трубки, а в нее — сетка с исследуемым материалом. Опускающиеся нематоды собираются в трубке наружной воронки, в то время как бактерии и простейшие вместе с избытком воды поднимаются между стенками воронок. Края внешней воронки находятся точно на уровне основания сетки.
Все методы опрыскивания, точность которых, как правило, превышает 80%, пригодны для учета родов Aphelenchoides, DU tylenchus, Pratylenchus, а также активных стадий видов Meloidogyne. Выход нематод из корней происходит за 7—10 дней, из побегов или листьев — за 3—5 дней.
Методы центрифугирования. Механическое разрушение растительных тканей и последующее центрифугирование полученной суспензии позволяет выделять как подвижные, так и неподвижные стадии эндопаразитических нематод.
Центрифугирование подвижных нематод. Тщательно вымытую и измельченную (5 мм) пробу корней с большим количеством воды гомогенизируют в миксере в течение 15 сек и полученную суспензию пропускают через набор сит (диаметр отверстий 1 мм и 10 мкм). Осадок на тонком сите смывают струей воды, переносят в центрифужный стакан, добавляют около 1 мл каолина и тщательно смешивают с суспензией. После центрифугирования (5 мин при 1800 g) надосадочную жидкость сливают, а оставшийся осадок суспендируют с помощью вибромешалки в концентрированном растворе сахара (d = 1,15) и еще раз центрифугируют 3 мин при 1800 g. Полученный осадок пропускают через сетку в 10 мкм, отделяя нематод от раствора сахара. Нематод с сетки нужно сразу же смыть и перенести в сосуд с водой.
Центрифугирование подвижных нематод и яиц. Вымытые и разрезанные корни измельчают 180 сек в гомогенизаторе, суспензию пропускают через сетку (1 мм) и смешивают с равным объемом воды. После добавления каолина и перемешивания с помощью вибромешалки проводят первое центрифугирование (5 мин при 1800 g), сливают надосадочную жидкость, осадок суспендируют в растворе сахара (вибромешалка) и второй раз центрифугируют не более 3 мин при 1800 g. Полученную суспензию пропускают через тонкую сетку (10 мкм), осадок промывают струей воды из пульверизатора, чтобы удалить остатки раствора сахара, и смывают водой в сосуд.
Примечание. Чтобы уменьшить повреждение нематод плазмолитическим воздействием сахарного раствора, нужно по возможности сокращать время их пребывания в растворе сахара.