Цистообразующие нематоды имеют огромное хозяйственное значение, и на зараженность ими обследуются обширные площади сельскохозяйственных угодий, поэтому разработан целый ряд методов выделения цист из почвы.
Если для количественного учета цист в многочисленных сериях почвенных проб используются методы, требующие относительно сложного технического оборудования, то для диагностики нематод достаточно самых простых способов исследований.
Метод бумажных полос. Этот метод вымывания цист, называемый также Гросс-Люзевицким, не требует сложного оборудования. Исследуемый образец почвы доводят до воздушно-сухого состояния и просеивают через сито с отверстиями 1 мм, остаток на сите выбрасывают. Цилиндрический сосуд (колбу Эрленмейера, химический стакан, сосуд из пластика) выстилают полосой фильтровальной бумаги шириной 10 см, так чтобы ее концы хорошо находили друг на друга, и вливают воду до увлажнения бумаги на 2/3. Особенно внимательно нужно следить за равномерным прилеганием полосы к стенкам сосуда. При медленном, осторожном добавлении в сосуд почвы и таком же осторожном перемешивании происходит отделение тяжелых частиц почвы от более легких, которые всплывают. После отстаивания почвы в сосуд добавляют маленькую каплю детергента. Затем полоску фильтровальной бумаги осторожно вынимают и помещают на пластинку из стекла или пластика. Содержавшиеся в почве цисты вместе со всплывшими частицами оседают на полоске бумаги, причем подавляющая их часть концентрируется в виде узкой каймы. Далее можно проводить подсчет или диагностику.
При больших сериях образцов почвы просушивание и просеивание требует значительных затрат времени. Кроме того, свежие, довольно тяжелые цисты (например, Зерновых нематод) частично не поддаются учету, так как они совсем или почти не всплывают, в результате возможны довольно большие ошибки опыта.
Примечание. Перемешивание при суспендировании почвы должно идти в направлении перехлеста концов бумажной полоски, в противном случав она может отделиться от стенок сосуда.
Прибор Фенвика. Исследуемую почву, воздушносухую и просеянную через сито, смывают сильной струей воды в сосуд для промывки, оснащенный сеткой и воронкой. Глубоко погруженная в сосуд трубка воронки обеспечивает хорошее перемешивание почвенной суспензии. Тяжелые частицы почвы оседают на наклонно вмонтированном сборочном экране, а всплывающие частицы и цисты поднимаются на поверхность воды и через слив попадают на систему сит (1 мм и 300 мкм).
Воду подают до полного осветления стока. Остаток с тонкой сетки переносят в белую чашку и просматривают под стереомикроскопом. Для очистки прибора открывают выходное отверстие и смывают все остатки.
Этот метод промывки, разработанный Фенвиком, позволяет проводить в большом объеме обычные и серийные испытания и быстро дает хорошие результаты при вымывании цист картофельной и свекловичной нематод. Исследования на зараженность зерновыми нематодами, свежие цисты которых имеют большую массу, сопряжены со значительными ошибками опыта.
Прибор Вильке. Промывочный прибор Вильке разработан для серийных исследовании почвенных проб. Пробу (свежую, воздушно-сухую, просеянную или непросеянную) объемом 200—400 мл засыпают через воронку в 1—2-литровую колбу из стекла, металла или пластика. В течение двух минут почву суспендируют сильной струей воды (давление воды на выходе не ниже 150 кПа) при вращательном движении шланга.
За счет подъема воды (при использовании двухлитровых колб скорость потока воды должна составлять 2,5—2,8 л/мин) цисты и легкие органические частицы поднимаются на поверхность, откуда через слив попадают на набор сит. Процесс всплывания считается законченным, если стекающая вода теряет мутность. Крупные частицы почвы задерживаются на грубом сите, на сите с отверстиями 300 мкм собираются мелкие органические частицы и цисты нематод. При очень неравномерном их распределении тонкое сито снимают и опускают в плоскую, наполненную водой чашку, чтобы материал лежал равномерно. Исследование остатка проводят под стереомикроскопом. Светлый шаблон, подложенный под сито, гарантирует систематический просмотр поверхности.
Для очистки колбы и набора сит используют встроенное моющее устройство, которое приводится в действие ножной педалью, или шланговый душ. Грязная вода и осадок почвы отводятся под основание прибора в отстойник, очищенную воду спускают в канализацию.
Этот метод, используемый уже многие годы в соответствующих службах защиты растений, вполне пригоден для обычных исследований, но требует определенных затрат на оснащение (три подключения к водопроводу, отстойник, подключение к канализации и др.). К преимуществам метода относится обработка влажных и непросеянных почвенных проб. Совсем свежие, невсплывающие цисты (зерновые нематоды!) не всегда поддаются учету, поэтому следует учитывать ошибку опыта соответственно возрасту цист.
Метод Баунаке. Несмотря на разработку рациональных и усовершенствованных методов выделения цист, простой метод сит по Баунаке не потерял актуальности, так как он позволяет, хоть и при относительно высокой затрате времени, получить все цисты независимо от их удельной массы.
Исследуемую совершенно не обработанную почву тщательна перемешивают с 8—10-кратным количеством воды и полученную суспензию без отстаивания пропускают через набор сит (отверстия 3 мм, 1 мм, 250 мкм). На двух первых ситах остаются крупные частицы почвы, на тонком собираются цисты и мелкие частицы почвы. Смыв остаток в белый лабораторный сосуд, можно выделить цисты, родов Globodera, Heterodera и Punctodera.
Метод выделения цист по Мюллеру. Метод, предложенный Мюллером для извлечения из почвы цист свекловичной нематоды, позволяет обрабатывать относительно большие количества почвы. Он представляет собой комбинацию просеивания с последующим центрифугированием.
Образец почвы объемом 100—150 г промывают через сито. Остаток на сите, цисты и частицы почвы размером более 100 мкм с помощью вибромешалки тщательно смешивают с 6 г каолина, смесь переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 5 мин при 1800 g. Оседающие в первую очередь почвенные частицы и цисты покрываются затем каолином, что предупреждает их слив вместе с надосадочной жидкостью. Вращение сосуда при сливе позволяет смыть цисты, осевшие на стенках сосуда, и перенести их на сито с отверстиями 50 мкм. К осадку в центрифужном стакане добавляют раствор сахара (d = 1,1), обрабатывают вибромешалкой и центрифугируют 3 мин при 1800 g, отделяя частицы почв от цист. Плавающие в растворе сахара цисты сливают на сито с отверстиями 50 мкм и промывают чистой водой для освобождения от остатков сахарного раствора.
Остаток, состоящий только из цист, переносят в пластмассовый стакан, в который введен валик цистодробителя. Высвобожденные личинки и яйца можно подсчитать под микроскопом.
Преимущество метода заключается в исключении длительного отделения вручную цист от огромного количества органических частиц почвы и в возможности быстрого количественного учета популяции нематод. Ошибка опыта не превышает 10%. В то же время для этого метода нужны мощная центрифуга, вибромешалка и цистодробитель.
Метод выделения цист по Дерну. Этот метод, разработанный Дерном для серийных обследований почвы на заражение цистами, представляет собой комбинацию просеивания почвенных проб с методом бумажных полос. Непросеянную, но воздушно-сухую почву с помощью ручного душа промывают через набор сит (отверстия от 1,2 мм до 250 мкм). Самые крупные частицы почвы остаются на крупном сите, более мелкие кусочки корней, органические частицы почвы, тонкий песок и цисты удерживаются на тонком. Ополоснув изнутри края тонкого сита, их выкладывают узкой полоской фильтровальной бумаги так, чтобы ее концы находили друг на друга. Затем сито помещают в сосуд, примерно на 5 см заполненный водой. При добавлении капли детергента (фит, отрок и др.) плавающие на поверхности цисты собираются у стенок сосуда. Этот процесс ускоряется при одновременном использовании маленького вентилятора с направленным потоком воздуха. Затем сито вынимают из сосуда. Большинство цист, легкие органические частицы и отдельные семена сорняков остаются на бумажной полоске. При наличии большого числа тяжелых, не плавающих в воде цист (незрелые белые цисты, свежие цисты зерновых нематод) воду заменяют насыщенным раствором магнезии или сульфата цинка.
Полоску фильтровальной бумаги, усеянную цистами нематод, раскладывают под стереомикроскопом на твердой пластиковой подложке. Для подсчета цист пригоден заостренный стальной пинцет.
Метод тест-растений. Идентификация некоторых видов и биотипов галловых и цистообразующих нематод очень сложна и трудоемка (срезы вульвы) из-за их значительного морфологического сходства. Относительно легче определять этих высокоспециализированных паразитов по способности к галло — и цистообразованию на специфических растениях-хозяевах, что в конечном итоге привело к созданию сортимента тест-растений. В частности, биотест для диагностики Heterodera schachtii разработан до такой степени точности, что дает не только количественную, но и качественную оценку зараженности почвы свекловичной нематодой.
Образец исследуемой почвы (2500 мл) смешивают с фунгицидом для защиты от болезней всходов (1,5 г ольпизана или тиурама 85) и засыпают в 15 чисто вымытых 7-сантиметровых горшков. В каждый горшок высаживают по два проростка сахарной свеклы, предварительно выращенных в почве, не содержащей нематод (8—10 дней, 15—18 °С). Контролем служат 15 горшков, содержащих почву с известной плотностью заражения. Для уменьшения потери влаги горшки можно поставить в пластмассовые поддоны или во влажную торфяную крошку; последнюю из-за опасности заражения нематодами используют только один раз.
В месте размещения горшков освещенность должна составлять не менее 10 000 лк при 14-часовом световом периоде, поэтому при проведении биотеста в период с ноября по февраль необходимо дополнительное освещение. Температура в течение светового дня — 18—22 °С, при темновом периоде — около 15—18 °С. Следует обеспечить равномерное снабжение растений водой, не допуская как переувлажнения, так и высыхания почвы. На 3-й и 5-й неделе от начала опыта растения подкармливают 0,3%-ным раствором полного удобрения. Для борьбы с вредителями (тли) проводят окуривание дихлофосом, опрыскивания инсектицидами следует избегать.
Оценку поражения проводят примерно через 8 недель путем подсчета цист на корнях с наружной стороны земляного кома, а при очень сильном укоренении — также на корешках, расположенных в глубине. Заселенность в пределах 30 цист требует точного подсчета, при наличии большего их числа результат обозначается величиной 30+. Если при полном отсутствии цист на поверхности исследуют корни, находящиеся внутри земляных комов, и обнаруживают на них более трех цист, необходимо провести повторную серию тестирования. Наличие в среднем менее трех цист на горшок указывает на слабую зараженность исследованной почвы, подсчет можно не проводить.
Заселенность яйцами и личинками каждых 100 г исследуемой почвы можно определить по средней арифметической из 15 отдельных показателей на горшок. Оценка 30+ учитывается при выведении средней как значение 30, при условии, что эта величина получена менее чем по 50% горшков. Если оценка более чем по 50% горшков составила 30+, то по этому значению оценивают всю серию, что соответствует наличию более 2500 яиц и личинок в каждых 100 мл почвы.
Аналогичный метод разработан Штельтером и Троммером для определения зараженности и оценки плотности популяции картофельной цистообразующей нематоды (Globodera spp.) в почвенных пробах.
В 15—17 горшков (предусмотреть два резервных горшка) засыпают три литра исследуемой хорошо перемешанной почвы и высаживают по одному клубню картофеля. Если задача заключается лишь в обнаружении нематоды, следует выбрать сорт, восприимчивый ко всем патотипам, идентификация же патотипов требует применения соответствующих сортов-дифференциаторов. Биотест проводится с конца ноября до середины мая. Клубни с наклюнувшимися ростками к началу опыта дают дружные и ранние всходы.
В месяцы с коротким световым днем желательно (но необязательно) дополнительное освещение. При поддержании температур в пределах 12—22 °С и оптимальном водообеспечении результаты теста можно оценивать уже через два месяца в стадии желтого или белого окрашивания цист.
Подсчитывают все цисты на поверхности земляного кома, причем число их в пределах 50 устанавливается точно, а при наличии более 50 цист результат обозначается как 50+. Средняя из 15 отдельных значений принимается за основу оценки. С помощью графика, по заселенности цистами определяют число личинок на 100 г почвы. Если по более чем 30% исследуемых горшков показатель составляет 50+, среднее значение также будет соответствовать 50+.
Этот тест позволяет получить достаточно точный для практических выводов количественный результат заражения нематодами в пределах 1000 личинок на 100 см3 почвы; популяции больших размеров такой оценке не поддаются.
Методы оценки жизнеспособности цист. При изучении динамики популяций, определении инфекционности нематод или разработке мер борьбы приобретает значение оценка степени жизнеспособности цист, поскольку морфологические признаки или подвижность обычно не позволяют сделать какие-либо достоверные выводы.
Жизнеспособность рекомендуется оценивать по результатам обработки цист различными красителями.
1. Исследуемых нематод помещают на 24—36 ч в раствор хризоидина (1 : 200 000). При этом мертвые особи приобретают равномерную желтую окраску, живые совсем не окрашиваются либо становятся бледно-желтыми, а их кишечник — оранжевым и зернистым. Поврежденные, менее жизнеспособные нематоды отличаются соответствующими переходами в окраске.
2. Нематод опускают на 10 мин в раствор малахитовой зелени (0,05%). Мертвые особи и яйца окрашиваются в зеленый цвет интенсивно, живые — лишь очень незначительно.
3. Нематод оставляют на период от 1 до 24 ч (в зависимости от вида) в 0,05%-ном растворе нойблау-R. Мертвые особи окрашиваются в цвета от фиолетового до насыщенного пурпурного, живые не изменяют окраски.
4. Весьма надежен и точен метод окрашивания мелдоласипим (0,5%). Для разрушенных цист, свободных яиц и личинок достаточно 30-минутного выдерживания в красителе, но для неповрежденных цист время окраски нужно удлинить до 24 ч при одновременном добавлении к раствору детергента. Мертвые и поврежденные яйца и личинки почти всегда окрашиваются в синий цвет, здоровые и жизнеспособные личинки большей частью остаются неокрашенными.
Методы определения содержимого цист. Степень заполненности цист сильно варьирует в зависимости от условий их развития, возраста и частичного вылупления личинок, поэтому число цист в пробе почвы — это недостаточный критерий для количественных выводов. Как правило, более приемлемы данные, полученные на основе подсчета числа личинок и яиц в цистах.
Для этого вполне пригодны простое вскрытие или раздавливание цист и подсчет их содержимого, хотя такая методика слишком трудоемка, особенно если нужны репрезентативные выборки или скапливается относительно большое число проб. Более рациональным является применение высокоскоростных гомогенизаторов.
Отсчитанное число цист, достаточное для репрезентативной выборки, помещают в стеклянные колбочки с водой и разрушают с помощью гомогенизатора в течение 3—5 мин при 35 000 об/мин. Затем суспензию яиц и личинок переносят в химический стакан и, поддерживая ее гомогенность с помощью вибромешалки, отбирают определенные равные объемы для подсчета. По полученным данным можно вычислить среднее число яиц и личинок на цисту.
Зная число цист на единицу почвы (обычно на 100 г), можно определить соответствующую степень заселенности яйцами и личинками. При отсутствии вибромешалки равномерного распределения яиц и личинок в суспензии достигают путем добавления карбоксиметилцеллюлозы (0,5%) и тщательного перемешивания.
Подсчет яиц и личинок при очень больших сериях проб проводят путем измерения адсорбции света, проходящего через суспензию. В этом случае цисты дробят в растворе карбоксиметилцеллюлозы. Величину заселения цист определяют по заранее полученным калибровочным кривым.