Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления лекарственной устойчивости микроорганизмов.
В последние годы ПЦР все чаще применяют для исследования различных свойств патогенных микроорганизмов, в том числе и для выявления лекарственной устойчивости. Как правило, использование ПЦР для определения чувствительности микроорганизмов целесообразно лишь в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы неприменимы или недостаточно эффективны.
Для подобного анализа обычно используют ДНК или РНК возбудителя, выделенного в чистой культуре. Однако в некоторых случаях имеется возможность прямого ПЦР-анализа на антибиотикорезистентность без предварительного культивирования возбудителя. Исследуемый образец клинического материала при этом используют как источник ДНК-мишени для ПЦР, а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу с целью выявления мутаций, связанных с антибиотикорезистентностъю.
Преимуществами ПЦР помимо высокой специфичности и высокой чувствительности являются скорость и высокая производительность. Так, например, выделение, идентификация и определение лекарственной устойчивости у штаммов метициллинрезистентного S. aureus с помощью традиционных микробиологических методов требуют не менее 3…5 сут, в то время как ПЦР-анализ — менее чем сутки. Существуют, однако, естественные ограничения для использования генетических методов оценки лекарственной устойчивости микроорганизмов: а) отсутствие данных о конкретных генетических механизмах резистентности; б) резистентность к определенным препаратам часто обусловлена с разными механизмами и мутациями в различных генах, которые независимо влияют на фенотип. Например, резистентность грамотрицательных бактерий к аминогликозидным антибиотикам может быть вызвана продукцией различных аминогликозидмодифицирующих ферментов или изменением проницаемости клеточной стенки. В этом случае результаты ПЦР-анализа, который всегда характеризует строго определенный специфический участок ДНК, не могут служить основанием для оценки чувствительности микроорганизмов в целом.
Использование тест-методов для определения антибиотикорезистентности микроорганизмов. Тест-методы — это рутинные приемы биологического, химического тестирования и индикации веществ и организмов с использованием простейших средств и методов. Их применение целесообразно для определения антибиотикорезистентности микроорганизмов, так как хромосомная и плазмидная устойчивость в основном обусловлена функцией или модификацией белков. У ряда кокков антибиотикорезистентностъ связана с модификацией участвующих в синтезе клеточной стенки пенициллинсвязывающих белков (ПСБ) — мишени действия β-лактамных антибиотиков, а у других бактерий — синтезом ферментов, инактивирующих препараты, — β-лактамаз и β-лактамаз расширенного спектра действия, аминогликозидмодифицирующих ферментов и других белковых субстанций.
Так, например, в последние годы за рубежом разработана и применяется диагностическая тест-система для латекс-агглютинации, позволяющая за 20 мин идентифицировать метициллинрезистентные штаммы S. aureus; совпадение с детекцией устойчивости на агаре составило 93,6 %, а выявлением в ПЦР гена mecA — 98,5 %. Кроме того, разработаны и диффузионные тест-методы (метод «двойных дисков» и Е-тесты) обнаружения у представителей семейства кишечных бактерий бета-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС).