Широкое использование в биологии методов точных наук — химии, физики, кристаллографии — привело к возникновению новых научных направлений, таких, как биофизика, биоорганическая химия, молекулярная биология, молекулярная биофизика и т. д.
Успехи, достигнутые за последние 10—20 лет в физико-химической биологии, значительны и разнообразны, но мы ограничимся фрагментарным рассмотрением лишь двух вопросов: о материальном субстрате процессов жизнедеятельности и регуляции протекающих в организме процессов обмена веществ.
Электронная микроскопия с разрешением до 2 Å открыла новый мир структурных образований в клетке. Особенно важным и интересным оказалось установление того факта, что структурные образования ядра и цитоплазмы выполняют специализированные функции. В ядре происходит синтез нуклеиновых кислот, нуклеотидов, нуклеопротеидов, благодаря чему обеспечивается процесс передачи информации, осуществляемый на генетическом уровне. В митохондриях за счет энергии окисления различных веществ образуются богатые энергией соединения, в частности аденозинтрифосфорная кислота. Именно в ней, как известно, в связях между фосфатными группами аккумулируется энергия в легко утилизируемой форме. Рибосомы — ничтожно малые частицы, не более 200 Å в диаметре, с коэффициентом седиментации (осаждение) 70S, состоящие из двух неравных субчастиц с коэффициентами седиментации 30 S и 50S, служат местом синтеза белков. Лизосомы представляют собой мешочки, заполненные раствором гидролаз, обладающих большой расщепляющей силой и т. д. В клетке широко представлены комплексы, образованные различными веществами, однако важнейшая часть клетки и ее структурных компонентов — белки.
На исключительную роль белков еще в 1838 г, обратил внимание Г. Мульдер, назвавший их протеинами, т. е. первейшими или важнейшими по значению, без участия которых жизнь невозможна. В 1895 г. один из крупнейших представителей органической химии А. фон Бейер, настроенный весьма скептически, считал, что нет никакой надежды в ближайшем будущем выяснить природу белка. Любопытно, что уже через пять лет А. Бейер оказался свидетелем работ Э. Фишера и Ф. Гофмейстера, установивших пептидную структуру белка.
В 1916 г. Э. Абдерхальден и А. Фодор синтезировали пептид, состоявший из 19 аминокислотных остатков и дававший ряд реакций, характерных для белковых веществ. Однако знание даже всех 20 качественно различных аминокислот, входящих в состав белка, не обеспечивало расшифровки его строения. Число возможных сочетаний 20 аминокислот составляет более двух квинтиллионов (2·1018). Поэтому установить последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка казалось делом почти безнадежным, не говоря уже об искусственном лабораторном его синтезе. Пионером в этой области оказался Ф. Сангер — молодой биохимик Кембриджского университета, предпринявший в начале 40-х годов исследование первичной структуры белкового гормона инсулина, состоящего из 51 аминокислоты. Работа потребовала 10 лет напряженного труда. Ее результаты были опубликованы в 1953 г. и стали одним из важнейших научных достижений нашего времени. Вскоре С. Мур с сотрудниками в результате трехлетней работы расшифровали первичную структуру белка, состоящего из 124 аминокислот, — поджелудочной рибонуклеазы.
Несколько лет назад в совместной работе двух лабораторий, руководимых академиком Ю. А. Овчинниковым и академиком А. Е. Браунштейном, была установлена первичная структура аспартаттрансаминазы — белка, состоящего из 412 аминокислотных остатков. В настоящее время последовательность аминокислотных остатков в белках широко анализируют во многих лабораториях мира, и число расшифрованных первичных структур, вероятно, приближается к 1000. При знании последовательности расположения аминокислотных остатков в белке синтез его уже не казался невозможным. И действительно, уже осуществлен лабораторный синтез ряда белков, в первую очередь гормона инсулина и фермента рибонуклеазы,
Параллельно химическому анализу аминокислот в 50-е годы все больше внимания начал привлекать рентгеноструктурный анализ кристаллических белков, позволявший определять их пространственную конфигурацию. Именно благодаря этим исследованиям удалось представить пространственную структуру миоглобина, α- и β-цепей гемоглобина, рибонуклеазы, лизоцима и др. Очень много усилий тратится на определение пространственной конфигурации, или третичной структуры белков-ферментов. Интересна история установления белковой природы ферментов. По-видимому, впервые, впрочем, без достаточных оснований белковую природу ферментов постулировал Н. Е. Лясковский в 1862 г., писавший, что белки при известных условиях могут играть роль ферментов. Очень четко на белковую природу ферментов указывал И. П. Павлов. В его «Лекциях по физиологии» читаем: «Ферменты — тела белковой природы». Один из его сотрудников Е. А. Ганике в работе, опубликованной в 1901 г., приравнивал ферменты ко «всякому белковому веществу», а другой сотрудник, В. Н. Керстен, в 1902 г. писал: «Пепсин — очень сложное белковое вещество». Кстати, это полностью подтвердилось: лишь совсем недавно в результате рентгеноструктурного анализа Н. С. Андреевой удалось установить трехмерную структуру пепсина.
Итак, в лаборатории И. П. Павлова на рубеже двух столетий и в самом начале XX в. белковая природа ферментов была не только постулирована, но и экспериментально доказана применительно к ферменту желудочного сока — пепсину. Несмотря на это, в фундаментальном руководстве по энзимологии Г. Эйлера, вышедшем в 1925 г., говорится: «энзимом… называют вещество животного или растительного происхождения неизвестного состава и неизвестной структуры». А в обстоятельном учебнике К. Оппенгеймера и Р. Куна (1927 г.) сказано: «Все ферменты, выделенные до настоящего времени приблизительно в чистом виде, не дают реакции ни на белки, ни на углеводы. Все полученные Р. Вильштетером чистейшие препараты ферментов не содержат белка и углеводов». Считалось также, что ферменты всегда проявляют свое каталитическое действие, присутствуя лишь в ничтожно малых количествах.
Получение в 1926 г. Дж. Самнером кристаллической уреазы и доказательство ее белковой природы, а затем получение Д. Нортропом в 1930 г. кристаллического пепсина, наконец, открытие Б. А. Энгельгардтом и М. Н. Любимовой в 1940 г. ферментативных свойств миозина — белка, составляющего 40% всех мышечных белков у высших животных, противоречили общепринятым взглядам. Лишь после повторных проверок данные Д. Нортропа, а также В. А. Энгельгардта и М. Н. Любимовой были безоговорочно приняты и составили одно из основных положений современной энзимологии.
Свойства и строение белковых веществ, их первичную и третичную, т. е. пространственную, структуру, условия ассоциации в более крупные конгломераты (четвертичная структура), а также диссоциацию на составляющие компоненты изучают в настоящее время главным образом на выделенных и очищенных препаратах Индивидуальных ферментов. В качестве примера сложного конгломерата ферментов можно назвать пируватдегидрогеназу скелетных мышц, обладающую молекулярным весом около 10 млн., гомогенную при седиментации и осуществляющую по крайней мере пять отдельных ферментативных актов; Этот белковый комплекс легко разбить на составные части, каждая из которых также обладает сложной четвертичной структурой и подвергается в определенных условиях дальнейшей диссоциации на индивидуальные белки с молекулярным весом в несколько десятков тысяч — в среднем около 50 тыс. Таким образом, в структуру начального комплекса с 10-миллионным молекулярным весом входит около 200 индивидуальных белков.
Методы электронной микроскопии, ультрацентрифугирования, высоковольтного электрофореза, спектро — и флуориметрии, ядерного магнитного и электронно-парамагнитного резонанса, масс-спектрометрии и радиографии, а также другие методы физики и химии широко вовлекаются в анализ структуры как молекул ферментов в целом, так и отдельных их частей.
Естественно поставить вопрос: что предопределяет пространственную (третичную) структуру белков, в частности белков-ферментов, а следовательно, и формирование их активного центра, от конфигурации которого зависит выполнение каталитической функции?
В настоящее время на этот вопрос можно, по-видимому, ответить однозначно. В самой последовательности аминокислот в молекуле белка заложена пространственная структура, которая связана с образованием в цепи аминокислотных остатков перегибов и петель, формирующих белковую глобулу.
Одно из новых, важных и перспективных направлений в физике и химии белка — детальный анализ свойств отдельных аминокислотных остатков, обусловливающих изгибы и повороты пептидной цепи. Это направление исследований широко представлено у нас в Институте белка АН СССР в работах академика А. С. Спирина, О. Б. Птицына, В. И. Лима и др. Подразделив аминокислоты на гидрофобные (малые, средние и большие) и гидрофильные (малые и большие), они сформулировали ряд правил, определяющих ту роль, которую играют в образовании перегибов и спиралей пептидной цепи отдельные аминокислотные остатки, входящие в первичную структуру белка. Пространственная структура ряда белков, представленная на основании этих правил по расчетным данным, хорошо соответствовала результатам, полученным экспериментально путем рентгеноструктурного анализа.
Таким образом, третичную структуру белка со всеми его биологическими особенностями, а для ферментов _ каталитическую активность предопределяет структура первичная, т. е. последовательность расположения в белке аминокислотных остатков. Тем более важно было выяснить, как складывается и чем предопределяется первичная структура белка при его синтезе, обеспечивающем полное обновление белков в разные сроки в зависимости от их локализации в органах и тканях, качества и функции.
Развитие исследований по этой проблеме насчитывает немногим более 20 лег. Их начало можно отнести к 50-м годам нашего столетия, когда была выяснена структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), входящей в состав хроматина клеточного ядра, и когда были охарактеризованы разные формы рибонуклеиновой кислоты (РНК), присутствующей как в ядре, гак и главным образом в цитоплазме.
В результате длительных и обстоятельных исследований Э. Чаргаффом и его сотрудниками в 1950—1953 т были установлены закономерности, касающиеся содержания четырех нуклеотидов — двух пуриновых и двух пиримидиновых в составе ДНК. Эти закономерности получили название правил Чаргаффа, Согласно им в ДНК содержание пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов одинаково, так же как общее количество амино — и окси — соединений. Одновременно с химическими исследованиями Чаргаффа ряд исследователей, особенно Р. Франклин и М. Уилкинс, проводили рентгеноструктурный анализ выделенных и очищенных препаратов ДНК. Учитывая накопившиеся результаты двух направлений исследований, Д. Уотсон и Ф. Крик с замечательной прозорливостью предложили в 1953 г. пространственную модель ДНК в виде двойной спирали, состоящей из двух антипараллельных нуклеотидных цепей с общей осью. Рисунки этой модели приводятся обычно во всех учебниках по биологии.
Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды соединены в этой спирали попарно водородными связями и обращены внутрь нее. Витки спирали образуют большую и малую бороздки. Предполагалась, что в больших бороздках расположены белки щелочного характера — гистоны, образующие с ДНК нуклеопротеидный комплекс, способный к диссоциации и освобождению ДНК. В настоящее время допускается также другая структура хроматина ядра: четыре различных гистона соединены попарно, формируя каркас или стержень, вокруг которого спиралеобразно накручена ДНК, вступающая в реакцию с гистонами, образуя нуклеопротеидный комплекс. Большую роль в изменении структуры нуклеопротеида должны играть модификации гистонов путем их метилирования, ацетилирования и фосфорилирования. Исследования в этой области ведутся весьма интенсивно.
Как уже упоминалось, рибосомы прокариот состоят из двух субчастиц: малой и большой. Большая субъединица состоит из двух РНК и содержит более 30 различных белков, малая субчастица содержит одну РНК и 20 различных белков. В настоящее время белковые компоненты рибосом выделены и охарактеризованы. Их локализация и взаимное расположение изучены и описаны. На долю каждой субчастицы и рибосомы в целом выпадает ряд сложных актов в процессе синтеза белка. В исследованиях этого процесса достигнуты замечательные результаты, которые невозможно обойти молчанием. Хотя, конечно, наш обзор будет поверхностным и схематичным.
Свободная мРНК в цитоплазме фиксируется на малой субчастице рибосомы, которая спеииализирована на связывании различных компонентов, участвующих в синтезе белка. Сюда же, к малой субчастице, связавшей мРНК, доставляются аминокислоты, транспортируемые специфическими транспортными РНК (тРНК) в виде аминоацил-тРНК. Характерные комбинации из трех нуклеотидов (триплеты) формируют в тРНК антикодоны, комплементарно связываемые триплетами нуклеотидов — кодонами матричной РНК. В этот момент к малой субчастице присоединяется большая, формируя цельную рибосому. Следующий этап заключается в передвижении — скольжении рибосомы по мРНК с переходом аминоацил-тРНК с малой частицы на большую. Это освобождает малую субчастицу для акцептирования следующей аминоацил-тРНК. Теперь осуществляется синтез пептидной связи.
Образовавшийся пептид сначала удерживается на аминоацил-тРНК, расположенной на малой субчастице, а затем передвигается на один триплет и размещается на большой субчастице, вытесняя оказавшуюся свободной тРНК. На свободную малую субчастицу доставляется новая аминоацил-тРНК, и акт синтеза пептидной связи повторяется до тех пор, пока не последует сигнал терминации — завершения синтеза. Тогда пептидная цепь переходит в среду, где формируется трехмерная структура белка уже согласно другим закономерностям.
Сложный процесс синтеза белка, осуществляемый в минутные и даже секундные интервалы времени, во многих деталях остается нерасшифрованным, хотя общий план его ясен. Открыто много индивидуальных белков и выяснено, что они участвуют во взаимоузнавании компонентов синтеза, в сигнализации начала, продолжения и прекращения синтеза. В то же время механизм осуществляемых этими белками функций остается загадочным и требует дальнейших исследований. Все рассказанное относится главным образом к синтезу белка у прокариотов.
Возвращаясь к вопросу о наследственности процессов, связанных с биосинтезом белка, можно сформулировать следующее положение: характерная структура ДНК предопределяет структуру мРНК, последовательность триплетов нуклеотидов в мРНК предопределяет первичную структуру синтезируемого белка. Итак, последовательность «ДНК — мРНК — белок» — это основная догма молекулярной биологии. Однако сравнительно недавно выяснилось, что под влиянием фермента обратной транскриптазы может происходить формирование ДНК на используемой в качестве матрицы РНК. Если учесть, что матричную РНК, кодирующую синтез определенного белка, можно выделить, то использование ее как матрицы для синтеза ДНК равносильно получению гена заданного типа, предопределяющего своей структурой качество синтезируемого белка. Эта проблема активно разрабатывалась в ряде научно-исследовательских учреждений нашей страны совместно с некоторыми институтами ГДР и ЧССР и завершилась присуждением Государственной премии за эти исследования большому коллективу научных работников во главе а академиком В. А. Энгельгардтом.
Нельзя не упомянуть о крупных успехах, достигнутых в биосинтезе нуклеотидов различной сложности, а также о лабораторных синтезах нуклеиновых кислот С заданной последовательностью нуклеотидов.
Как известно, последовательность нуклеотидов во многих РНК установлена. Первичной структуре тРНК придают обычно форму клеверного листа. Выяснена также и пространственная структура тРНК фенилаланила, У нас вклад в эту область исследований внесен академиком А. А. Баевым, которому удалось выяснить последовательность нуклеотидов в двух валиновых тРНК. Им разработан также метод химического разрезания тРНК на части, позволяющий локализовать в молекуле отдельные функциональные группы и оценить их роль в реакциях, характерных для тРНК. В настоящее время в нескольких зарубежных лабораториях и у нас разрабатываются проблемы искусственного синтеза ДНК и РНК с заранее заданной последовательностью нуклеотидов, Это большая и сложная задача. Ее решение будет иметь серьезное практическое значение.
Исследования, о которых я говорил до сих пор, принято относить к молекулярной биологии, так как они касаются информационной функции нуклеиновых кислот и реализации этой функции в специфическом биосинтезе белков. Нарушение или выпадение любого звена, участвующего в биосинтезе белков, неизбежно приведет к патологическому состоянию организма. Ввиду исключительного разнообразия функций белков — ферментативных, рецепторных, транспортных, сократительных, иммунных и т. д. — проявления патологии могут быть также весьма различными. Даже при нарушении образования только одного белка-фермента, например участвующего в биосинтезе кофермента, необходимого многим дегидрогеназам, наблюдаются весьма сложные патологические проявления.
Небезынтересно, что как в прошлом, так и в настоящее время анализ дефекта обмена веществ нередко приводил к открытию ранее не известных ферментов и катализируемых ими реакций. Так было, например, с болезнью Рифсама, описанной в начале 60-х годов нашего столетия. Это тяжелое наследственное заболевание нервной системы приводит к расстройству моторики, заключающемуся в нарушении координации движений. Оказалось, что это заболевание связано с нарушением α-окисления жирных кислот. Такой путь превращений у млекопитающих и человека ранее не был известен; его анализ привел к описанию новых ферментов и промежуточных продуктов обмена веществ.
Понятно, насколько важно знать механизм и последовательность протекающих в организме реакций, чтобы иметь возможность выявить нарушенное звено в их течении и целенаправленным воздействием устранить дефект.
В организме белки и нуклеиновые кислоты широко образуют комплексы не только между собой, но и с другими веществами — липидами, углеводами, минеральными веществами, входя в состав физиологических жидкостей и клеточных структур. В расшифровке строения и функций этих соединений также достигнуты крупные успехи. Выяснены все этапы, которые проходит биосинтез холестерина из ацетил-КоА, осуществляющийся с использованием обоих углеродных атомов ацетильного остатка. Установлены пути последующего образования из холестерина стероидных гормонов и желчных кислот. Проанализирована роль липидов в построении мембран. Достаточно изучены пути синтеза жирных кислот и сложных липидов, а также роль липидов и углеводов как источников энергии, потребляемой организмом.
Как в простых, так и в более сложных многоклеточных организмах процессы обмена веществ и энергии, синтеза и распада, развития и деградации протекают закономерно и слаженно. Причина упорядоченности химических реакций, протекающих в организме, лежит в строгой и многосторонней их регуляции. Системы регуляции исключительно разнообразны и относятся к различным уровням — от влияния центральной нервной системы на процессы обмена веществ до изменений в проницаемости клеточных мембран или в молекулярной структуре ферментов. Для иллюстрации этих положений сошлемся на исследования по проблеме свертывания крови, проведенные Б. А. Кудряшовым в МГУ на здоровых молодых людях — студентах.
Оказалось, что после первого экзамена в зимнюю сессию у них наблюдается задержка, а после последнего экзамена в конце учебного года — явное ускорение в образовании сгустка. Б. А. Кудряшов приходит к выводу, что длительное систематическое эмоциональное напряжение приводит в конце года к истощению системы, обеспечивающей защиту от гиперкоагуляции, т. е. от повышенной свертываемости крови. Для центральной нервной системы обязательна смена деятельного состояния и покоя. Оказывается, от этого зависит содержание РЫК и белковых компонентов мозга.
Часто, однако, влияние нервной системы на процессы тканевого обмена веществ осуществляется посредством гормональных факторов — мощных регуляторов биосинтеза, активации и ингибирования ферментов. Особенно подробно было исследовано влияние кортикостероидов — кортизона и гидрокортизона — на ферменты, специфически обусловливающие превращение аминокислот триптофана и тирозина. Активность этих ферментов в печени животных после введения гормонов повышалась примерно в 10 раз.
По мнению Р. И. Салганика (СО АН СССР), в клеточном ядре представлены различные гены, программирующие образование как обычных ферментов, так и неустойчивых изоформ тех же ферментов, однако появляющихся в клетках лишь в особых, напряженных, так сказать, авральных, условиях. Например, из четырех изоформ гексокиназы лишь одна, по мнению Р. И. Салганика, нарастает под влиянием инсулина. Эта форма неустойчива в отношении к протеолизу и быстро исчезает при прекращении авральной ситуации и возвращении клетки к нормальной жизни.
Мы очень бегло рассмотрели некоторые вопросы, касающиеся материального субстрата процессов жизнедеятельности и регуляции обмена веществ. Но даже такой фрагментарный обзор свидетельствует, что за последние десятилетия произошли коренные изменения наших представлений в этих областях физико-химической биологии. Вместе с тем становится все более очевидным, что решение одного вопроса вызывает постановку новых задач, требующих новых экспериментальных исследований, а иногда и принципиально новых методических подходов. Впрочем, это не вызывает у нас удивления, так как хорошо известно, что развитие науки беспредельно. Человек все ближе подходит в овладению тайнами живой природы. На наших глазах новые, ранее не познанные ее области становятся подвластными разуму и воле человека. Дело его чести и благоразумия использовать свои знания и способности для обеспечения мира, здоровья, благосостояния и счастья людей.
Автор: С. Е. Северин, академик