Вторая четверть нашего столетия характеризуется развитием экспериментальной цитологии и значительным расширением арсенала цитологических исследований.
В то же время современный период характеризуется тесной взаимосвязью цитологии и физиологии, с одной стороны, цитологии и физико-химических наук, с другой стороны. Для историка науки характеристика этого периода — дело нелегкое, и не только потому, что нет еще исторической перспективы. Само количество исследований, их многообразие в последнее время возрастает, как лавина. Если уже в конце прошлого столетия подчас нелегко определить долю участия того или другого ученого в определенном открытии, то сделать это теперь особенно трудно. Поэтому эта глава будет отличаться неизбежной неполнотой и фрагментарностью.
Тканевые культуры явились одним из первых экспериментальных методов, сыгравших большую роль в познании клетки. Харьковский профессор И. П. Скворцов еще в 1885 г. создал условия для переживания клеток крови, но в качестве настоящей культуры этот опыт рассматривать нельзя, так как размножения клеток не происходило. Лео Лёб (Leo Loeb, 1869—1959) впервые (1897, 1902), использовав в качестве культуральной среды свернувшуюся кровь и лимфу, наблюдал выселение в среду отдельных клеток и их деление. Точных условий опыта он не опубликовал. Создателем методики культур явился американский биолог Гаррисон (Ross Granville Harrison, 1870—1959), приготовивший в 1907 г. настоящую тканевую культуру в свернувшейся лнмфе и указавший принципы культур in vitro. Его сотрудник Берроус (М. Т. Berrows) в 1910 г. применил вместо лимфы плазму крови. Эпоху в развитии метода культур in vitro составили опыты американского хирурга Карреля (Alexis Carrel, 1873—1944), начатые с 1911 г. Каррель показал способ длительного культивирования клеток с помощью пересадок и смены среды. Исследования отечественных гистологов А. А. Максимова (1874—1928), А. А. Кронтовского (1885— 1933), А. В. Румянцева (1889—1947), Н. Г. Хлопина (1897— 1961), А. Д. Тимофеевского, а из иностранных исследователей, в первую очередь, супругов Льюис (Warren Н. and Margaret R. Lewis), Стрэнджуэйса (T. Strangeways), Фишера (Albert Fischer, 1891 —1956), Леви (Giuseppe Levi), Мёллендорфа (W. v. Mollendorff, 1887—1943) и др. во многом обогатили учение о клетке. Метод культур позволил прижизненно исследовать размножение клеток, процесс их роста и дифференцировки, влияние условий среды на жизнедеятельность клеток. Сводки А. Фишера (1930), А. В. Румянцева (1932) ,и Н. Г. Хлопина (1940) отражают применение этого метода во второй четверти нашего века. Блестящие успехи принесло соединение культур с цейтраферной съемкой, осуществленное впервые в Англии Канти (R. G. Canti). Последним шедевром в этом отношении является фильм, снятый польскими исследователями супругами Байер (A. Bajer, J. Mole-Bajer), где на растительных клетках при фазовом контрасте с поразительной ясностью показан ход митоза. Новые возможности для цитологии открыл метод трипсинизированных культур, разработанный в 50-е годы и позволивший получать культуры из единичных клеток, что раньше считалось невозможным.
Еще в прошлом веке делались попытки операций на клетках, преимущественно на протистах (так называемая меротомия). С изобретением микроманипуляторов Чемберсом (Robert Chambers, 1881 —1957) в 1912 г. и Петерфи (Tibor Peterfi, 1883—1953) в 1922 г. стали осуществимы операции над тканевыми клетками. Появились возможности экспериментального изучения физических свойств клетки, извлечения из клеток и перемещения ее отдельных компонентов, и ряд других воздействий на клетку.
Новые экспериментальные возможности открыло применение витальных красителей. Одно направление такой методики основывалось на изучении отложения взвешенных частиц красителя при его витальном введении. Этим методом было выяснено распространение макрофагов и их значение, что привело к развитию учения о ретикуло-эндотелиальной системе (L. Aschoff, 1922; Н. Н. Аничков, 1930). От исследований Н. А. Хржонщевского (1836—1907) и А. О. Ковалевского идет другое направление: изучение выделительной функции клеток путем введения кислых красителей. Для цитологии наибольшее значение получил метод использования основных красителей, восходящий к (работам П. Эрлиха (1885). В цитологических целях этот метод успешно использовал Н. Г. Хлопни (1927), открывший с его помощью так называемую криному — белоксодержащие частицы, появляющиеся в результате сегрегации в клетках витального красителя. Это направление у нас весьма успешно развивается Б. В. Кедровским. Применение основных витальных красителей широко использовали Д. Н. Насонов и В. Я. Александров (1940), создавшие с помощью этой методики учение о паранекрозе — неспецифическом повреждении клетки, которое наступает вначале при действии различных агентов. Реакцию клеши на внешние воздействия они объяснили на основе денатуранионной теории повреждения, которая продолжает успешно разрабатываться учениками Д. Н. Насонова.
Охарактеризованные направления относятся к физиологической цитологии, которая в наше время представляет собою один из активно разрабатываемых разделов цитологии. От простого наблюдения и описания строения клетки цитологи перешли к экспериментальному изучению разных сторон жизнедеятельности клеток. Подробно изучается физиология митоза: влияние среды на ход деления, действие гормональных факторов и нервной системы, суточный ритм.
Продолжается исследование физических свойств клетки, вязкости протоплазмы, реакции клеток на внешние воздействия, изучение кортикального слоя клеток, и т. п. В последние годы широкую дискуссию вызвала проблема клеточной проницаемости; здесь развернулась борьба между приверженцами старой мембранной теории и новой сорбционной теории (Д. Н. Насонов и его школа). Если прежде основным направлением цитологии было морфологическое исследование, то в наше время в центре внимания цитологов все более становятся цитофизические и цитохимические проблемы. От упрощенного коллоидно-химического представления о протоплазме (протоплазма — многофазный коллоид с мицеллами, взвешенными в дисперсионной среде) снова возникает идея о структурности протоплазмы, на этот раз субмикроскопической. Применение поляризационного микроскопа (W. J. Schmidt, 1938), применение рентгеновского метода исследования набухания, вязкости, проницаемости, абсорбции и механических свойств протоплазмы (A. Frey-Wyssling, 1948) создало новое представление о протоплазме как трехмерной сети нитевидных белковых молекул, соединенных готовыми к реакции боковыми цепями; в пространствах этой сети находятся липиды, углеводы, с которыми реагируют боковые цепи протеинового остова. Однако, как замечает Баргман (W. Bargmann, 1960), «мечтой биолога была очная ставка с картинами этого структурного мира, а не только конструирование структурных схем». Эта мечта становится реальностью с введением электронного микроскопа.
Отдельные цитохимические методы начали внедряться в цитологию давно, но лишь к 40-м годам нашего столетия оформляются задачи и методы цитохимических исследований. Вначале цитохимия еще остается в неразрывной связи с гистохимией, но в дальнейшем эмансипируется в самостоятельную область исследования. Характерно, что монография Лизана (L. Lison) в 1-м издании (1936) называлась «Животная цитохимия», а во 2-м издании (1953) появилось название «Животная гистохимия и цитохимия». Прекрасная сводка Брате (Jean Braehet, 1957.) характеризует состояние и задачи этой новой области учения о клетке.
Кроме того направления цитохимии, которое идет от цитологии, наметилась и другая ветвь, идущая от биохимии: суммарное биохимическое исследование изолированных клеточных структур. В 1932 г. Беренс (М. Behrens) выделил клеточные ядра в такой массе, которая позволяла их химическое исследование. Бенсли и Херр в 1934 г. выделили из лиофилизированного (материала митохондрии, а Лазаров (A. Lazarnw) и Клод (A. Claude, 1943) разработали способ дифференцированного центрифугирования гомогенизированных тканей.
Успехи цитологии в последние десятилетия неразрывно связаны с новыми методами микроскопического исследования. Открылись новые возможности использования светового микроскопа. Большие услуги оказал метод фазового контраста, расширивший прижизненное изучение клетки. Принцип фазового контраста разработан в 1934 г. (F. Zernike), но сначала не нашел применения. Его использование в цитологии началось после работ Кёлера и Лооса (A. Kohler, W. Loos, 1941). Разновидностью этого метода является аноптральная микроскопия (A. Wilska, 1953). Недавно оригинальную конструкцию аноптрального микроскопа предложил у нас М. А. Пешков (1955).
В 1908 г. Кёлер и Зидентопф (Siedentopf) сконструировали люминесцентный микроскоп, значительно улучшенный и упрощенный Леманом (Н. Lehmann, 1913). Основанный на использовании естественной люминесценции объекта, этот микроскоп вначале нашел ограниченное применение. Позже нашли способ пропитывания биологических объектов люминесцирующими красителями (флуорохромами) и в последние десятилетия применение люминесцентного микроскопа значительно расширилось. Особенно широко в наших лабораториях применяется сконструированный Е. М. Брумбергом и С. А. Гиршгориным люминесцентный микроскоп с опак-иллюминатором. Для цитологических целей весьма успешно применил люминесцентную микроскопию М. Н. Мейсель, возглавивший у нас это направление исследования.
Все большее применение находит ультрафиолетовая микроскопия в ее разных вариантах. Прогресс здесь был достигнут введением отражательного объектива (Е. М. Брумберг и С. А. Гиршгорин, 1943). Позже Е. М. Брумберг (4954) разработал аппаратуру для ультрафиолетовой флуоресцентной микроскопии.
Но, конечно, новую эру (в учении о клетке создал электронный микроскоп. Его открытие подготовлялось исподволь, и трудно указать, кто является его изобретателем, так как вначале дело шло о физических исследованиях катодных лучей, безотносительно к возможности практического их использования в микроскопии. Лишь в 1928 г. была найдена методика управления электронным лучом и возникла идея электронного микроскопа (Н. Rusca, Knoll, Borries). Но первые электронные микроскопы были непригодны для цитологических исследований. Электронные микрофотографии были получены в начале 30-х годов. В 1933 г. Руока превысил в электронном микроскопе предельное увеличение светового микроскопа. Все же до начала 50-х годов цитологическое применение электронного микроскопа было ограниченным, так как не умели изготовлять достаточно тонких срезов. В 1949 г. была предложена заливка в метакрилат (S. В. Newman, Е. Borysko, М. Swerdlow), а в 1952 г. Палад (G. Е. Palade) ввел в употребление фиксацию материала для электронной микроскопии с помощью забуференной осмиевой кислоты. Наконец, созданием ультрамикротомов, первая конструкция которых появилась в 1948 г., а затем была усовершенствована в 1953—1954 гг., было преодолено затруднение в изготовлении достаточно тонких срезов. Современные ультрамикротомы позволяют получать срезы толщиной до 50 Å. Разрешающая способность электронных микроскопов доведена до 10 Å. Если предельное увеличение светового микроскопа доходит примерно до 2000, то теперешние электронные микроскопы позволяют получать увеличение в 800 000—1 200 000 раз. Скачок поистине гигантский!
С помощью электронного микроскопа за последние десять лет получены факты, заставляющие во многом пересмотреть представления о строении клетки, создавшиеся в начале нашего века. Нет возможности перечислить эту массу новых фактов. Наиболее поразительные результаты получены в отношении строения цитоплазмы. Палад (1953) и Шёстранд (F. S. Sjostrand, 1953) показали сложную мембранную структуру митохондрий. В дальнейшем мембранная структура оказалась универсальным типом строения внутриклеточных структур. Шёстранд и Ганзон (V. Hanzon, 1954) открыли мембранную структуру аппарата Гольджи, а в 1955 г. Шёстранд в гиалоплазме, которая считалась гомогенной и оптически пустой, открыл систему цитомембран, совокупность которых «получила название эргастоплазмы. На этих цитомембранах Палад (1955) установил наличие гранул, содержащих рибонуклеиновую кислоту (рибосомы). Стал раскрываться тот внутриклеточный аппарат, который связан с интимными процессами клеточного метаболизма. Открытие мембранной структуры — одно из самых поразительных достижений электронной микроскопии. Но и различные фибриллярные образования при изучении в электронном микроскопе приобрели совсем новый смысл и оказались разложенными на протофибриллы разного типа, о которых ранее мы ничего не знали.
Однако насколько широко раздвинула электронная микроскопия наше познание строения цитоплазмы и ее органоидов, настолько сравнительно мало дал этот метод в отношении строения ядра. Здесь пока примат остается за световым микроскопом, хотя нет сомнения в том, что развитие методики электронной микроскопии позволит в дальнейшем и в ядре открыть не менее поразительные факты, чем те, какими мы уже располагаем в отношении цитоплазмы.
Надо отметить, что электронная микроскопия еще более упрочила ряд основных положений клеточной теории. Соответствие общего строения клеточных структур животных и растений оказалось более глубоким, чем это ранее показал световой микроскоп. В ряде случаев там, где ранее предполагалась неклеточная структура, электронно-микроскопическое исследование выявило клеточное строение.