Факультет

Студентам

Посетителям

Вторичная и третичная структура белка

После установления деталей ковалентной структуры белка можно перейти к сопоставлению этих деталей с физико-химическими особенностями поведения белков в растворе.

Общее число положительных и отрицательных зарядов вдоль полипептидной цепи должно соответствовать величинам, получающимся при титровании белков щелочами или кислотами. Зная число остатков тирозина, фенилаланина и триптофана в молекуле, можно заранее определить форму и высоту кривых поглощения ультрафиолетовых лучей при длине волны 250— 290 мμ. Определения содержания сульфгидрильных групп в белке должны подтверждать результаты определений содержания цистеина.

Однако исследователи, проводящие подобные сравнения, не были особенно удивлены, когда оказалось, что такого рода предсказания весьма редко соответствуют действительности. Обычно многие заряды бывают замаскированы или сняты, спектры поглощения смещены по сравнению с теоретически предполагаемыми, а сульфгидрильные группы часто выявляются в полной мере только после сильной денатурации молекулы белка. Все эти отклонения обусловлены рядом известных, но, вероятно, также и многими неизвестными параметрами вторичной и третичной структуры, которые мы попытаемся коротко охарактеризовать.

Мы уже говорили о вероятности спирального свертывания белков как об основе вторичной структуры. В соответствии с размерами а-спирали и величиной ее шага каждый остаток в полипептидной цепи должен занимать 1,5 А в витке спирали. Таким образом, общая длина спирали, состоящей из n аминокислотных остатков, должна составлять n · 1,5А.

Проведя широкие исследования, вязкости, рассеяния света и особенностей седиментации синтетической полиаминокислоты поли-γ-бензил-L-глутамата в соответствующих растворителях, Доти с сотрудниками получил данные, полностью согласующиеся с теоретическими вычислениями; при экспериментальном определении длина молекулы в ангстремах оказалась равной числу остатков в цепи, умноженному на 1,5. Следует подчеркнуть, что хотя для удобства изложения часто применяется слово «спираль», однако предположение о спиральном свертывании глобулярных белков основано лишь на весьма косвенных данных. Мы можем твердо говорить о том, что в молекуле таких белков существует какое-то упорядоченное свертывание цепей, однако не следует представлять себе это свертывание исключительно в форме α-спирали, пока на этот счет не будут получены дополнительные данные. Нельзя считать доказанным, что все белки содержат именно такие структуры; этот вопрос, особенно для глобулярных белков, в настоящее время изучается очень активно.

Успех изучения свойств спиральных систем в растворах в большой мере связан с применением методов исследования вращения плоскости поляризации. Математическая теория вращения плоскости поляризации белков чрезвычайно сложна и спекулятивна. Однако, несмотря на теоретические трудности, здесь наблюдается хорошее совпадение данных и создается возможность предсказывать результаты на основании изучения вращения плоскости поляризации. Поэтому этот метод можно считать вполне пригодным с чисто эмпирической точки зрения.

Величина вращения плоскости поляризации белка складывается из нескольких компонентов. Одним из этих компонентов является средняя величина вращения для отдельных аминокислотных остатков в полипептидных цепях. На основании изучения этого вращения делается заключение об определенном, повторяющемся характере спиральной конфигурации, если она присуща структуре. При изучении вращения у синтетических полиаминокислот, относительно которых можно сделать допущение, что степень их свертывания в спираль меняется с изменением растворителя, было экспериментальным путем показано, что угол вращения плоскости поляризации для полностью свернутой цепи равен примерно 90° (для D-линии натриевой лампы). Величина этого угла выше той, которой можно было бы ожидать теоретически, исходя из вычисления средней величины для самих аминокислотных остатков. Эта чисто эмпирическая величина может быть использована как основа для вычисления степени спирального свертывания белка.

Значение вращения на один остаток свернутого белка получено измерением вращения плоскости поляризации нативного белка в воде, а определяли в присутствии таких веществ, как мочевина или гуанидин, или же при повышенной температуре, когда свертывание, которому придают устойчивость водородные связи, по-видимому, нарушается. Представлены некоторые результаты определения вращения плоскости поляризации вместе с данными о степени свертывания этих белков. Измерение вращения плоскости поляризации белка, находящегося в несвернутом состоянии, можно также произвести на образцах, в которых дисульфидные поперечные связи были разрушены при восстановительном или окислительном расщеплении. В отсутствие таких стабилизирующих связей спираль, очевидно, неустойчива, и мы наблюдаем в этом случае такое вращение, какого следовало бы ожидать на основании величины вращения плоскости поляризации в расчете на один аминокислотный остаток (примерно от —100 до —120°).

Однако для сохранения спиральной конфигурации молекулы белка одних дисульфидных мостиков недостаточно. Следует помнить, что такие вещества, как, например, мочевина, могут вызвать дезориентацию вторичной структуры даже при наличии неповрежденных дисульфидных связей. По-видимому, многие особенности третичной структуры также оказывают влияние на свойства белка в растворе. О наличии таких структурных взаимодействий свидетельствует ранее упомянутое несовпадение между экспериментально определенными величинами для ионизируемых групп, сульфгидрильных групп и т. п., с одной стороны, и величинами, которые можно вывести на основании одних только данных о чередовании аминокислот, — с другой.

Функциональные группы, у которых наблюдаются измененные свойства, можно подвергнуть количественному изучению. Отличным примером служит спектрофотометрическое изучение белков. Впервые такое исследование было проведено Краммером и Нейбергером. Эти исследователи показали, что спектр поглощения для яичного альбумина в области, характерной для остатка тирозина, был смещен по сравнению со спектром поглощения самого тирозина в сторону коротких волн. Эти данные показали, что поглощение энергии света хромофором тирозина было несколько изменено под влиянием среды, в которой находятся остатки тирозина в молекуле белка.

Подобные наблюдения были впоследствии сделаны при изучении целого ряда других белков, в том числе рибонуклеазы, лизоцима и альбумина сыворотки крови. В конце концов было показано, что сдвиг, характерный для отклоняющегося от нормы спектра, можно снять веществами типа мочевины, которые вызывают разрыв водородных связей. Одновременно освобождались карбоксильные группы, переходившие в титруемую форму. До этого карбоксильные группы были замаскированы и их не удавалось оттитровать щелочью. Число таких освобождающихся кислых группировок примерно равно числу остатков тирозина, которое, согласно вычислениям, вызывало смещение максимума экстинкции. Эти данные позволили обнаружить взаимодействие гидроксильных групп тирозина с карбоксильными группами.

Необходимо отметить, что спектральная характеристика тирозина нативной рибонуклеазы (а также других белков, у которых наблюдались подобные же явления) в какой-то степени напоминает характеристики, наблюдаемые при ионизации фенольной гидроксильной группы свободного тирозина. В обоих случаях наблюдается сдвиг спектра в направлении более длинных волн, а также возрастание поглощения. По-видимому, образование водородной связи может вызвать изменения спектра, аналогичные изменениям, возникающим при ионизации, и связанные с увеличением расстояния в фенольной связи О—Н. Действительно, в ряде спектрофотометрических исследований было обнаружено наличие сдвига спектра в красной области в условиях, благоприятствующих образованию водородных связей.

На этом этапе анализа уже была подготовлена почва для открытия этих особых взаимодействий, затрагивающих водородные связи, поскольку в настоящее время имеется простой метод их исследования, а именно спектрофотометрический. Можно также предполагать наличие в белках и других группировок, соединенных водородными связями (например, связи между аминогруппами и карбоксильными группами или между двумя карбоксильными группами), но обнаружить их из-за отсутствия подходящих методов пока не удалось.

До сих пор мы рассматривали структуру белка, касаясь его свойств только в статическом или равновесном состоянии. Можно полагать, что ковалентные связи в белках способны противостоять большей части изменений, происходящих в окружающей среде. В известном смысле эти связи определяют пространственную конфигурацию, способствуя установлению фиксированного распределения зарядов и лиофобных группировок вдоль полипептидной цепи и создавая основу для возникновения жестких и постоянных поперечных связей. Однако ковалентные связи обладают все же некоторой гибкостью; незначительные деформации углов между связями, вращение атомов вокруг ординарных связей — все это дает возможность белкам принимать в растворе ряд разнообразных, незначительно отличающихся друг от друга конфигураций. Когда мы устанавливаем для данного препарата белка его вязкость, вращение плоскости поляризации или поведение при ультрацентрифугировании, то полученные результаты характеризуют только некую среднюю молекулу в растворе. В общем отклонения от этой средней, вероятно, довольно велики, так как некоторые конфигурации значительно более устойчивы (т. е. обладают более низкой свободной энергией конфигурации). Однако незначительные различия в конфигурации белковой молекулы, несомненно, имеют большое значение с точки зрения биологической активности белков, и, к счастью, эти различия можно изучить с помощью некоторых особых методов, касающихся динамической стороны структуры белков.

Как уже было указано, можно выявить степень спирального свертывания белков путем измерения вращения плоскости поляризации, если допустить, что повторяющиеся структурные единицы асимметричной молекулы соответствуют виткам спирали. Теоретическое и экспериментальное подтверждение такого допущения достаточно обосновано, и поэтому оно принято в качестве рабочей гипотезы большинством специалистов. Допустив затем наличие определенного числа витков в спирали такого белка, как инсулин, и основываясь на ковалентной структуре, предложенной Сэнджером и его сотрудниками, можно построить разные модели. При построении таких моделей необходимо установить, где расположена часть молекулы, свернутая в спираль. Эта задача облегчается наблюдениями, показавшими, что беспорядочно расположенные полипептидные цепи, не сдерживаемые внутренними поперечными связями, не свертываются спонтанно в организованные структуры; об этом можно судить по изменениям вязкости и вращения плоскости поляризации после разрыва дисульфидных связей путем окисления или восстановления.

Таким образом, для инсулина мы можем предположить, что полипептидная цепь примерно на 60%, т. е. в той своей части, которая, согласно поляриметрическим исследованиям, имеет форму α-спирали, расположена, по всей вероятности, в пространственно устойчивом участке между дисульфидными мостиками, соединяющими цепи А и В.

Мы попытались дать представление о пространственной прочности свернутых в спираль частей цепи. Можно ожидать, что в этой части молекулы белка вероятность обмена атомов водорода из групп CONH, образующих водородные связи внутри спирали, с водородом воды, в которой растворен белок, гораздо меньше, чем вероятность обмена водородных атомов группировок боковой цепи или связей CONH, расположенных в части молекулы, не свернутой в спираль. Именно эту-то относительную устойчивость и удается определить при помощи метода обмена с дейтерием.

Этот метод — один из наиболее чувствительных для измерения динамического состояния белковой структуры. Особая ценность этого метода заключается в том, что даже в тех случаях, когда другие физические методы позволяют выявить спиральное строение лишь для средней равновесной формы белка, он дает возможность измерить степень отклонения от этой средней формы, связанного с обратимым размыканием и замыканием водородных связей, вследствие чего спираль, подобно аккордеону, то растягивается, то сжимается. Практически белок «насыщают» дейтерием, растворяя его в окиси дейтерия в течение времени, достаточного для осуществления обмена между всеми подвижными водородными атомами молекулы белка и дейтерием растворителя. Затем белок тщательно высушивают. При вторичном растворении в обычной воде происходит обмен атомов дейтерия на водородные атомы воды; скорость появления дейтерия, измеряемая по изменению плотности растворителя, позволяет разделить все способные к такому обмену атомы водорода на группы атомов, обменивающихся 1) мгновенно, 2) быстро и 3) медленно.

В инсулине содержится 91 атом водорода, теоретически способный к обмену, в том числе атомы водорода боковых цепей различных аминокислотных остатков и атомы водорода групп CONH, образующие полипептидную цепь. При растворении меченного дейтерием инсулина в воде при 0° из 91 атома водорода 60 моментально обмениваются на водород воды. При дальнейшей инкубации происходит дополнительный обмен других атомов водорода. Но при этой температуре скорость установления равновесия относительно низка. В присутствии таких денатурирующих веществ, как мочевина, или при высокой температуре равновесие устанавливается значительно быстрее и все атомы дейтерия в числе 91 в конце концов обмениваются.

Предполагается, что медленно обменивающиеся атомы водорода расположены в той части молекулы инсулина, которая свернута в спираль. Быстро обменивающиеся атомы расположены несколько более произвольно, но их, вероятно, можно частично отнести к тому участку цепи А, ограниченному дисульфидной связью, который, вклиниваясь на моделях в часть молекулы, свернутую в спираль, допускает образование дисульфидных мостиков внутри цепи только после существенной деформации связей. Этот интересный метод дает, вероятно, наиболее четкие доказательства в пользу существования постоянных мелких локальных изменений в строении белка, находящегося в растворе. Посредством этого метода с поразительной резкостью выявляется внутренняя неустойчивость трехмерной структуры белка, которая может приводить к его денатурации и потере биологической активности. При этом обнаруживается существование в белке некоторых структурных компонентов, о наличии которых несколько лет тому назад даже не подозревали.