Исследования, проведенные с помощью современных методов молекулярной биологии, убеждают в том, что вызванные инфекцией изменения в окислительном аппарате никогда не ограничиваются каким-либо одним ферментом.
Во всех без исключения случаях в реакцию тканей хозяина вовлекаются представители различных групп ферментов. Поэтому ответная реакция имеет характер весьма сложного сопряжения, при котором изменения в одной части окислительной системы взаимообусловлены изменениями в другой. Подобного рода сопряженность не может быть вызвана непосредственным действием микроорганизма на молекулы ферментов. В осуществлении такого типа реакции должна участвовать вся совокупность регуляторных механизмов, которыми вооружена протоплазма живой клетки. Экспериментальные данные подтверждают это положение. Установлено, что протопласты иммунных и неиммунных форм растений существенно различаются по физико-химическим свойствам, имеющим принципиально важное биологическое значение (например, степень прочности, стабильности структуры протоплазмы, ее компонентов и в первую очередь мембранных структур).
Процессы, связанные с первичной ассимиляцией энергии в акте фотосинтеза, ее преобразованием, запасанием и последующей реализацией в акте дыхания, осуществимы лишь при строго определенной, упорядоченной структурной организации хлоропластов и митохондрий. Вместе с тем сама структурная организация этих органоидов непостоянна, динамична. Она создается и поддерживается за счет осуществляющихся в них процессов энергообмена. Таким образом, функции органоидов неотделимы от их структуры, тогда как последняя целиком зависит от нормального функционирования этих компонентов протопласта. Именно этой взаимосвязью и обеспечивается тонкая авторегуляция отдельных реакций в органоидах, их последовательность, пространственная локализация и общая организация.
Одним из важнейших механизмов, регулирующих функционирование органоидов, являются обратимые изменения их объема — процессы набухания и сокращения. При этом важная роль принадлежит проницаемости внешних оболочек митохондрий — их мембран. Проницаемость мембран определяет интенсивность и направление транспорта метаболитов между экстра — и внутримитохондриальными системами. То же самое можно сказать и о передвижении метаболитов между внешней и внутренней мембранами, а также во внутреннем содеожимом митохондрий, Тот же механизм в конечном счете определяет энергетическую эффективность работы органоидов.
Данные, полученные в нашей лаборатории в последние годы, показывают, что сильное влияние на состояние митохондриального аппарата и хлоропластов оказывают также метаболиты микроорганизмов. Характер реакции на это воздействие у иммунных и неиммунных форм растений существенно различен. У неиммунных растений токсины вызывают резкие изменения в состоянии органоидов протопласта (набухание и увеличение размеров пластид и митохондрий, уменьшение размеров ядер). В результате у таких форм растений митохондрии практически полностью утрачивают способность синтезировать богатые энергией соединения типа АТФ. Митохондрии иммунных форм растений, наоборот, при внедрении инфекции практически не изменяют своего объема, не уменьшают способности к окислительному фосфорилированию, а в ряде случаев их активность в этом направлении даже возрастает.
Аналогичная картина обнаружена при изучении процессов фотофосфорилирования. Здесь нарушения в состоянии мембранных структур хлоропластов, например у неиммунного вида табака, приводят к снижению синтеза АТФ, в основе которого лежит уменьшение энергетической эффективности использования света (в расчете на единицу содержащегося в пластиде хлорофилла). У иммунного вида этот показатель под влиянием вируса не только не уменьшается, но даже существенно возрастает.
Метод определения концентрации свободных радикалов позволил получить представление об эффективности процессов передачи и использования энергии в живых системах. Определения концентрации неспаренных электронов с помощью метода электронного парамагнитного резонанса показали, что и эта сторона энергообмена осуществляется у иммунных форм растений значительно более эффективно, чем у неиммунных, у которых она в результате инфекции сильно подавляется. Как уже отмечалось, одним из факторов, обусловливающих способность тканей иммунных форм растений сохранять высокую эффективность процессов энергообмена, служит то, что инфекция стимулирует у них новообразование митохондрий, рибосом, пластид. При этом вновь образующиеся структурные элементы функционально весьма активны и не уступают в этом отношении элементам нативных тканей.
Итак, под действием патогенных агентов нарушается ультраструктурная организация митохондрий и хлоропластов, что влечет нарушение энергообмена.
Экспериментально установлены также факты денатурации структурных белков мембран, ослабления липопротеидных связей, уменьшения прочности связи пигментов с белками, изменения электрофоретических свойств этих комплексов. Резко возрастает проницаемость мембран для электролитов, а также для содержащейся внутри органоидов АТФ, что влечет за собой активную вымываемость последней и общее нарушение ионного баланса. Изменяется скорость и направление транспорта метаболитов между отдельными структурными компонентами органоидов.
Повреждения фотосинтетического аппарата служат причиной нарушения транспорта электронов, эффективного взаимодействия фотосистем и, как следствие, продуктивности использования солнечной энергии. Опыты, в которых изучался эффект, известный под именем длительного послесвечения (ДПС), подтвердили эти выводы. Необходимость разработки такого метода была обусловлена тем, что метод ССС применим только при исследовании тканей растений, лишенных пигментов. Для окрашенных же тканей используют метод, сущность которого состоит в следующем. Если лист осветить видимым светом, а затем поместить в темную камеру, то при помощи фотоэлектронного умножителя можно после прекращения освещения обнаружить затухающее в течение нескольких минут свечение в красной области спектра. Это явление обнаружено американскими биофизиками Б. Стрелером и В. Арнольдом в 1951 г. и известно под именем «Стрелеровское свечение».
Послесвечение является универсальным свойством фотосинтезирующих организмов. Оно обусловлено частичным обращением первичных этапов запасания энергии квантов света, поглощаемых пигментами листа. В результате поглощения света при фотосинтезе может возникнуть возбужденное состояние хлорофилла, дезактивация которого приводит к выделению квантов флуоресценции. Последняя и обнаруживается в виде послесвечения. Следует считать установленным также, что послесвечение не побочное явление. Его параметры тесно связаны с ходом фотосинтеза и прежде всего процесса фотофосфорилирования. Компоненты электронтранспортной цепи, ответственные за возникновение испускания света, лежат на основном пути использования энергии света в акте фотосинтеза в целом. Именно поэтому ДПС и привлекает внимание исследователей, как один из параметров, характеризующих физиологическое состояние растений при воздействии на них повреждающих факторов, включая и влияние, оказываемое патогенными микроорганизмами (Б. Н. Тарусов, Б. А. Рубин с сотрудниками).
ДПС регистрируется на специальных установках, позволяющих чередовать импульсы возбуждающего света с периодами темноты, во время которых и наблюдается послесвечение. Импульсы возбуждающего света следуют с большой частотой, благодаря чему электронная схема прибора регистрирует свечение в виде непрерывного уровня. Не останавливаясь на описании деталей, отметим лишь, что исследования особенностей ДПС и его основных параметров позволили выявить достаточно определенные различия в характере реагирования на заражение устойчивых и неустойчивых к вилту форм и сортов хлопчатника. Биологическая сущность этих показателей состоит в том, что у неустойчивых сортов уже на первых этапах заболевания отмечается нарушение процессов фотофосфорилирования.
Установлено, кроме того, что белковые компоненты их хлоропластов менее подвижны, менее способны к существенным изменениям своей структуры под действием света. Это, в свою очередь, свидетельствует о пониженной способности белковых компонентов осуществлять структурные переходы, обеспечивающие эффективность функций хлоропластов. У устойчивых сортов основные параметры послесвечения свидетельствуют о том, что нарушений фотофосфорилирования нет. Белковые компоненты фотосинтетического аппарата и система в целом сохраняли и после заражения свойственную им эластичность, способность к изменениям структуры, т. е. практически полностью сохранялись свойства здоровых, незараженных растений. Эти закономерности подтвердились при анализе значительного числа сортов хлопчатника различной устойчивости, что позволяет рассматривать ДПС как надежный показатель, который может быть использован в селекционной работе.
На один из возможных механизмов участия клеточных мембран в регуляции процессов патогенеза и иммунитета растений указывают исследования американского исследователя Г. Штробеля. Согласно его данным, в белковых структурах мембран содержатся компоненты, обладающие способностью специфически адсорбировать и связывать определенные составные части комплекса токсинов, синтезируемых паразитом. Это сопровождается активированием K-Mg-зависимой АТФ-азы, что, в свою очередь, приводит к резкому повышению проницаемости мембран для различных ионов. Обусловленные этим нарушения ионного баланса способны вызвать гибель инфицированной клетки.
Что касается утверждения Штробеля о якобы неспособности инфицированной растительной клетки к индуцированному биосинтезу белка, то оно коренным образом противоречит большому числу фактов, экспериментально установленных современными методами.